血清miR-31、miR-155和CCL26在溃疡性结肠炎中预后不良的诊断价值*

陈国雁 尚精娟 李敏虹 张慧君 刘建峰

(上海中医药大学附属第七人民医院消化内科,上海 200137)

溃疡性结肠炎是一种慢性非特异性结直肠炎,其发病率呈逐年增高的趋势,发病确切机制仍不清,可能与免疫、遗传和外源性因素刺激等密切相关[1-2]。由于病程长,复发率高,严重患甚至最终发展为结肠癌。因此,早期了解溃疡性结肠炎的病情和严重程度,有利于早期临床治疗和对疾病的控制[3]。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA,参与了疾病发生发展过程,有研究显示miR-31和miR-155在溃疡性结肠炎中呈高表达,并与趋化因子配体26(CCL26)的调节具有一定的联系[4]。现已知CCL26是趋化因子的成员之一,是炎症反应的重要调控因子[5]。然而溃疡性结肠炎患者血清miR-31、miR-155和CCL26异常表达是否对复发具有预测作用仍不清楚。本研究通过对溃疡性结肠炎患者血清miR-31、miR-155和CCL26表达,观察其在溃疡性结肠炎严重程度和复发的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年1月—2020年6月在我院收治的溃疡性结肠炎患者119例,根据Mayo评分将其分为活动期组(评分3～12分)65例和缓解期组(评分≤2分)54例。其中活动期组,男性35例,女性30例,年龄(23～68)岁,平均(42.27±5.83)岁;病程(5～31)月,平均(23.28±3.28)月,根据Mayo评分将活动期组患者分为轻度亚组(3～5分)25例、中度亚组(6～10分)22例和重度亚组(11～12分)18例。纳入标准：所有患者均符合溃疡性结肠炎的诊断标准[6];均行肠镜和病理学检查,临床资料完整。排除标准：自身免疫性和肿瘤性疾病;溃疡性结肠炎出现出血、穿孔、狭窄和梗阻等并发症;心、肝和肾等脏器功能不全;孕妇和哺乳期妇女;精神性疾病和智力下降者。另选择同期在我院健康体检者45例为对照组,其中男性23例,女性22例,年龄(25～65)岁,平均(43.01±4.28)岁。本研究各组患者均签署知情同意书,经医院伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 血液标本收集 患者入院时抽取肘静脉血约5 mL左右,在室温下静置约20 min,然后采用3000 r/min的离心机离心10 min,离心半径为15 cm,去上清液约3 mL,放置在-80 ℃的冰箱中待测,采用酶联免疫吸附试验测定血清CCL26的表达。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清中miR-31、miR-155 mRNA表达水平 采用TaqMan miRNA试剂盒提取细胞总的RNA,采用实时定量荧光PCR检测血清中的miR-31和miR-155表达。并根据目标基因的mRNA序列,设计引物,用设计软件Primer express 3.0软件设计反转录产物为模板,miR-31扩增引物正向：5′-GGCATAGCTGTTGAACTGGG-3′;扩增引物方向：5′-CGATCGTCAGCATCACTAGC-3′;miR-155扩增引物正向：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′;扩增引物方向：5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′;U6扩增引物正向：5′-GCGCTTGTGCTTGATCTAA-3′;扩增引物方向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反转录后以反转录产物为模板,采用实时定量PCR仪上间隙扩增,反应条件为在85 ℃反应3 min,在85 ℃反应20 s,在42 ℃反应40 s,总共循环35次,采用2-ΔΔCt表示miR-31和miR-155的相对表达量。

1.2.3 溃疡性结肠炎患者内镜下严重程度指数(UCEIS) 根据血管纹理、出血和糜烂和溃疡进行评分。血管纹理：正常为0分;斑块状消失为1分;全部消失为2分;出血：无出血为0分;黏膜渗血1分;肠腔内轻度出血为2分;肠腔内重度出血为3分。糜烂和溃疡：正常为0分;糜烂为1分;浅表溃疡为2分;深部溃疡为3分。总分为0～8分,分数越高病情越严重。

1.2.4 随访 通过对病史、电话、微信和门诊等方式对患者进行随访,每个患者均随访满2年,主要了解患者是否有复发、结肠出血、中毒性巨结肠或者恶变为预后不良,否则为预后良好。

1.2.5 观察指标比较及分析 比较各组血清miR-31、miR-155和CCL26水平的变化;分析各组血清miR-31、miR-155和CCL26水平与溃疡性结肠炎严重程度的关系及影响溃疡性结肠炎预后不良的单因素和多因素分析;评估血清miR-31、miR-155和CCL26水平在2年内溃疡性结肠炎发生预后不良的诊断价值。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 活动期组65例,其中男性35例,女性30例,年龄(23～68)岁,平均(42.27±5.83)岁;病程(5～31)月,平均(23.28±3.28)月;病变部位：直肠20例,乙状结肠21例,左半结肠13例和全结肠11例;缓解期组54例,其中男性26例,女性28例,年龄(22～66)岁,平均(41.96±4.78);病程(4～33)月,平均(22.75±4.06)月;病变部位：直肠16例,乙状结肠18例,左半结肠12例、全结肠8例;对照组45例,其中男性23例,女性22例,年龄(25～65)岁,平均(43.01±4.28)岁。3组在年龄和性别等基线资料比较差异无统计学意义,具有可比性(P<0.05)。

2.2 3组血清miR-31、miR-155和CCL26水平的比较 溃疡性结肠炎活动期组血清miR-31、miR-155和CCL26水平明显高于缓解期组和对照组(P<0.05),而缓解期组明显高于对照组(P<0.05),见表1。

表1 各组血清miR-31、miR-155和CCL26水平的比较

2.3 血清miR-31、miR-155和CCL26水平与溃疡性结肠炎严重程度的关系 血清miR-31、miR-155和CCL26水平随着溃疡性结肠炎严重程度的增加而升高(P<0.05),见表2。

表2 血清miR-31、miR-155和CCL26水平与溃疡性结肠炎严重程度的关系

2.4 溃疡性结肠炎出现预后不良的单因素分析 根据随访预后的不同分为预后良好组(40例)和预后不良组(25例),UCEIS评分>6分的比例预后不良组明显高于预后良好组(P<0.01),而血清miR-31、miR-155和CCL26水平预后不良组明显高于预后良好组

差异有统计学意义(P<0.01),见表3。

表3 溃疡性结肠炎出现预后不良的单因素分析

2.5 溃疡性结肠炎影响预后不良的多因素分析 将具有单因素分析具有统计学意义的指标UCEIS评分、miR-31、miR-155和CCL26水平,根据是否出现预后不良进行二元Logistics 回归,发现UCEIS评分>6分,血清miR-31、miR-155和CCL26水平升高是发生溃疡性结肠炎预后不良的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4 溃疡性结肠炎影响预后不良的多因素分析

2.6 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在溃疡性结肠炎出现预后不良的诊断效能 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在诊断溃疡性结肠炎发生预后不良具有较高的诊断效能,根据是否发生预后不良将上述指标进行二元Logistics回归得y=1.45×XmiR-31+1.69×XmiR-155+1.32×XCCL26-26.76为联合检测指标,联合检测的灵敏度为80%,特异度为99.4%,AUC为0.963明显高于单个指标miR-31(z=2.727,P=0.006)、miR-155(z=3.012,P=0.003)和CCL26(z=2.091,P=0.036),而三个指标之间的AUC比较差异无统计学意义(P>0.05),见表5、图1。

图1 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在溃疡性结肠炎出现预后不良的AUC比较

表5 血清miR-31、miR-155和CCL26水平在溃疡性结肠炎出现预后不良的诊断效能

3 讨论

溃疡性结肠炎是肠道内免疫耐受失衡,病变主要累及结肠黏膜层和黏膜下层,目前诊断主要依靠结肠镜和相关评分量表的评估[7]。最为常见的肠镜下UCEIS评分能够反映疾病严重程度的指标[8],主要反映血管纹理、出血和糜烂和溃疡的严重程度,相对在内镜直视下对溃疡性结肠炎进行病情严重程度评估,具有相对准确和快速评估等特点[9]。本研究结果显示UCEIS评分在溃疡性结肠炎预后不良组明显高于预后良好组,并发现UCEIS评分是溃疡性结肠炎预后不良的独立影响因素。但由于溃疡性结肠炎具有反复发作,对病情严重程度和预后的评估采用UCEIS评分具有一定局限性和患者的依从性较差[10-11]。因此,临床上寻找简单易行,已经获得的指标在评价溃疡性结肠炎的预后具有重要的临床价值。

miR-31作为miRNA的成员之一,参与了机体免疫应答多个环节,与多种感染性疾病和自身免疫性疾病具有重要作用,在维持机体免疫平衡的稳态具有重要作用[12-13],并发现miR-31在自身免疫性疾病和炎症性疾病的诊疗和预后具有密切关系,可能成为临床监测疾病的灵敏指标[14]。本研究结果显示溃疡性结肠炎患者活动期患者血清miR-31表达明显高于稳定期患者,并且随着疾病严重程度升高而升高,说明miR-31参与了溃疡性结肠炎疾病的发生发展。miR-31炎性肠病的研究中发现通过促进Th1的细胞因子的转录,抑制Th2细胞因子的过度转录,从而达到维持Th1/Th2细胞因子的平衡。在溃疡性结肠炎的组织中发现miR-31表达出现明显升高,具有促进溃疡性结肠炎疾病的发生发展[15-16]。在克罗恩病的研究中发现miR-31/IL-25信号轴的调节,从而达到对Th1/Th17介导的炎症反应进行调控,并且阻断miR-31的表达有助于克罗恩病的治疗[17]。本研究结果显示预后不良组患者血清miR-31表达水平明显高于预后良好组,并且发现血清miR-31表达水平升高是2年内出现预后不良的独立危险因素。本研究发现血清miR-31表达水平>6.72时,在预测溃疡性结肠炎2年内发生预后不良具有较高的诊断价值,其灵敏度为72%,特异度85%,AUC为0.820说明血清miR-31表达水平是溃疡性结肠炎预后的重要指标。

miR-155位于人体染色体22号,为非编码RNA,在转录区的第三个外显子内,在单核巨噬细胞、T细胞和B细胞活化时均有较高表达,而将其敲除后T细胞和B细胞的功能出现明显受损,说明miR-155在淋巴细胞的发育和免疫功能的激活具有重要作用[18]。在溃疡性结肠炎的研究发现血清或者组织出现miR-155的高表达,并认为miR-155在溃疡性结肠炎的发病过程中具有重要临床意义[19-20]。本研究证实溃疡性结肠炎活动期患者血清miR-155表达明显高于稳定期患者和对照组,并且发现随着溃疡性结肠炎的严重升高而升高,说明miR-155表达水平是溃疡性结肠炎严重程度的指标。本研究发现预后不良组血清miR-155表达明显高于预后良好组,并认为血清miR-155水平升高是溃疡性结肠炎预后不良的独立风险因素。有研究显示溃疡性结肠炎结肠黏膜呈高表达,并促进NF-κB信号通路的激活,介导机体释放大量的炎症因子参与溃疡性结肠炎的发生发展过程,在动物实验中肠道灌入miR-155抑制剂后,结肠黏膜炎症明显降低[21-22]。本组研究发现血清miR-155水平>2.66时,其诊断溃疡性结肠炎预后不良的灵敏度80%,特异度为70%,AUC为0.778说明在溃疡性结肠炎诊断预后不良具有较高的效能。

CCL26属于CC家族成员之一,是由77个氨基酸组成,其与CC趋化因子-3结合后,激活机体的嗜酸性粒细胞释放组胺和炎症因子,参与机体的过敏和炎症反应,作为急慢性炎症的评价指标[23]。本研究结果显示血清CCL26水平在溃疡性结肠炎活动期组明显缓解期组,并且随着病情严重程度的升高而升高,并且发现预后不良患者血清CCL26水平明显高于预后良好患者,并且发现血清CCL26水平升高是预后不良的独立危险因子。本研究显示当血清CCL26>9.66 pg/mL时,在预测溃疡性结肠炎发生预后不良的灵敏度为80%,特异度为85%,AUC为0.886,说明CCL26在预测溃疡性结肠炎发生预后不良具有较高的诊断效能。本研究还显示联合检测miR-31、miR-155和CCL26水平在预测溃疡性结肠炎发生预后不良具有更高的诊断效能,其灵敏度为80%,特异度为99.4%,AUC为0.963明显优于miR-31、miR-155和CCL26单个检测水平,说明三者存在某种互补性,可能与均参与了溃疡性结肠炎的病理生理过程有关。

4 结论

miR-31、miR-155和CCL26与溃疡性结肠炎的严重程度有关,联合检测有助于提高对溃疡性结肠炎2年内发生预后不良的诊断价值。