姜黄素灌胃对脂肪肝大鼠肠黏膜屏障损伤的改善作用及其机制

侯洪涛，张建，裘艳梅，李苹苹，郑吉敏，王玉珍，刘改芳

1 河北省人民医院消化科，石家庄 050051；2 河北医科大学第二医院儿科

长期高脂饮食会引起高血脂、高血糖、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、肥胖等多种疾病［1］。NAFLD是以肝脏脂质蓄积为病理改变的肝脏代谢性疾病［2］。随着人们饮食及生活方式的改变，NAFLD发病率逐年升高，流行病学调查［3］显示，NAFLD的全球患病率约为25.24%。“肠—肝轴”概念的提出为寻找肝病的发病机制和诊疗方法提供了新思路。NAFLD时常伴有肠黏膜屏障损伤，肠黏膜屏障损伤会加快NAFLD的病理生理进程［4］。NAFLD时肠黏膜氧化应激水平的升高是肠黏膜损伤的重要机制之一。核因子-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）是体内抵御氧化应激的重要转录因子，抗氧化反应元件可以与Nrf2结合，上调Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达，改善机体的氧化应激状态［5］。血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1， HO-1）是一种抗氧化酶，能够对抗细胞的氧化应激［6］。姜黄素是从植物姜黄中提取的疏水性多酚，现代药理研究表明姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用［7］。2020年6—10月，我们观察了姜黄素灌胃对脂肪肝大鼠肠黏膜屏障损伤的改善作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 姜黄素、大鼠、试剂及仪器 姜黄素购自美国Sigma公司。SPF级雄性SD大鼠45只，大鼠体质量190 ± 20 g克，动物许可证号：SCXK（冀）2018-004，实验动物、普通饲料及高脂饲料（10%猪油+2%胆固醇+0.5%胆盐+87.5%普通饲料）均购自河北医科大学实验动物中心。SOD试剂盒和MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；脂多糖（lipopolysaceharide， LPS）试剂盒购自湛江安度斯公司；二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗Nrf2多克隆抗体购自美国Bioworld公司；小鼠抗HO-1单克隆抗体购自武汉三鹰公司；兔抗β-actin单克隆抗体购自上海Abways公司；山羊抗兔IgG二抗购自柏奥易杰（北京）科技有限公司；山羊抗小鼠IgG二抗购自柏奥易杰（北京）科技有限公司。电子天平购自德国Sartorius公司，高速离心机购自德国Eppendorf公司，转移脱色摇床购自海门其林贝尔仪器制造公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，低温离心机购自德国Eppendorf公司，垂直电泳槽购自北京六一仪器厂，医用X射线胶片购自美国柯达公司，石蜡病理切片机购自德国LEIKA公司，光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 脂肪肝大鼠模型制备、分组、姜黄素给予方法 SD大鼠45只，适应性喂养1周，随机选取10只作为对照组，应用普通饲料喂养。其余35只继续高脂饲料喂养，每周测量大鼠体质量，建立脂肪肝模型。8周后，随机处死5只高脂喂养大鼠，通过肝组织切片确认脂肪肝模型制备成功。高脂喂养的其余30只大鼠进一步分为模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组，每组10只。姜黄素溶于1%的羧甲基纤维素钠，模型组继续给予高脂饲料喂养；姜黄素低剂量组在髙脂喂养的同时给予200 mg/（kg·d）姜黄素灌胃，每日1次；姜黄素高剂量组在髙脂喂养的同时给予400 mg/（kg·d）姜黄素灌胃，每日1次；对照组和模型组大鼠予以相同剂量的1%羧甲基纤维素钠灌胃；各组大鼠灌胃8周后，处死大鼠，留取肝脏、小肠组织和门静脉血用于后续实验。

1.3 各组大鼠肝脏、小肠组织病理学观察 取各组大鼠肝脏组织，制备石蜡切片，苏木精—伊红染色后，应用光镜观察肝脏脂肪变的程度。取各组小鼠小肠组织，制备病理学切片，苏木精—伊红染色后，应用光镜观察小肠黏膜绒毛的变化。

1.4 各组大鼠肠黏膜屏障功能指标观察 取大鼠门静脉血，按试剂盒说明书测定门静脉血浆LPS及门静脉血浆二胺氧化酶（DAO），使用全自动生化仪检测大鼠血清ALT、AST。

1.5 各组大鼠小肠组织氧化应激指标观察 取小肠组织，制备小肠组织匀浆，按试剂盒说明书，检测小肠组织丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.6 各组大鼠小肠组织中Nrf2、HO-1蛋白检测采用Western Blotting法。取小肠组织，剪碎后加入蛋白裂解液，制备匀浆液，提取细胞核蛋白Nrf2和胞浆蛋白HO-1并测定蛋白含量。蛋白煮沸变性后，将20 μg蛋白样品上样至12%SDS-PAG凝胶孔中，进行电泳，蛋白分离后将其转移至PVDF膜上，后将其置于5%脱脂牛奶中常温封闭1 h；将膜置于稀释后的第一抗体中［兔抗Nrf2多克隆抗体（1∶1000稀释）、小鼠抗HO-1单克隆抗体（1∶1000稀释）、兔抗β-actin单克隆抗体（1∶5000稀释）］，4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液对PVDF膜漂洗3次，以1∶10000的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗体溶液孵育2 h；以TBST漂洗3次，增强化学发光法显色，使用凝胶成像仪观察蛋白条带并拍照，用Image J软件分析图像，以β-actin作为内参照，结果以目的条带和内参照的OD比值来表示。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏、小肠组织病理学变化 ①各组大鼠肝脏组织病理学变化见图1。对照组大鼠肝细胞结构正常，无炎症反应；模型组大鼠可见肝细胞内可见大小不等的脂肪堆积，并有炎细胞浸润；姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组肝细胞脂肪变减轻，炎症浸润减少，并与给药剂量有关。②各组大鼠小肠组织病理学变化见图2。各组小肠黏膜形态未见明显异常，对照组绒毛高大、完整，无充血及水肿；模型组绒毛低矮、间隙增宽，结构破坏，不完整；姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组大鼠小肠绒毛比较完整，绒毛缺失减少，并与给药剂量有关。

图1 各组大鼠肝脏组织病理学变化（HE染色，×200）

图2 各组大鼠小肠组织病理学变化（HE染色，×100）

2.2 各组大鼠肠黏膜屏障功能指标比较 各组大鼠血浆LPS、DAO及血清AST、ALT水平比较见表1。由表1可知，与对照组相比，模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组大鼠血浆LPS、DAO及血清AST、ALT水平均升高（P均＜0.05），但姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组低于模型组（P均＜0.05），且有剂量依赖性（P均＜0.05）。

表1 各组大鼠血浆LPS、DAO及血清AST、ALT水平比较（±s）

表1 各组大鼠血浆LPS、DAO及血清AST、ALT水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与姜黄素低剂量组比较，△P＜0.05。

组别对照组模型组姜黄素低剂量组姜黄素高剂量组ALT（U/L）35.69 ± 9.5975.03 ± 10.86*52.65 ± 7.48*#44.00 ± 5.49*#△LPS（EU/mL）0.27 ± 0.090.55 ± 0.10*0.37 ± 0.07*#0.46 ± 0.07*#△DAO（U/mL）0.46 ± 0.141.06 ± 0.25*0.83 ± 0.18*#0.64 ± 0.12*#△AST（U/L）130.71 ± 14.09165.28 ± 10.26*153.47 ± 8.84*#141.60 ± 8.27*#△

2.3 各组大鼠小肠组织氧化应激指标比较 各组大鼠小肠组织MDA含量及SOD活性比较见表2。由表2可知，与对照组相比，模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组大鼠小肠组织MDA含量均升高（P均＜0.05），但姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组低于模型组（P均＜0.05），且有剂量依赖性（P均＜0.05）；与对照组相比，模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组大鼠小肠组织SOD活性均降低（P均＜0.05），但姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组高于模型组（P均＜0.05），且有剂量依赖性（P均＜0.05）。

表2 各组大鼠小肠组织MDA含量及SOD活性比较（±s）

表2 各组大鼠小肠组织MDA含量及SOD活性比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与姜黄素低剂量组比较，△P＜0.05。

SOD（U/mg）179.02 ± 12.56135.48 ± 16.48*154.70 ± 10.12*#166.74 ± 9.06*#△组别对照组模型组姜黄素低剂量组姜黄素高剂量组MDA（nmol/mg）3.55 ± 0.837.21 ± 1.39*5.65 ± 1.12*#4.60 ± 0.89*#△

2.4 各组大鼠小肠组织中Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较 各组大鼠小肠组织中Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较见表3。由表3可知，与对照组相比，模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组大鼠小肠组织中Nrf2、HO-1蛋白相对表达量均升高（P均＜0.05），且姜黄素低剂量组、姜黄素高剂量组高于模型组（P均＜0.05），且有剂量依赖性（P均＜0.05）。

表3 各组大鼠小肠组织中Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠小肠组织中Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与姜黄素低剂量组比较，△P＜0.05。

HO-1蛋白0.37 ± 0.100.54 ± 0.13*0.67 ± 0.11*#0.80 ± 0.13*#△组别对照组模型组姜黄素低剂量组姜黄素高剂量组Nrf2蛋白0.29 ± 0.060.40 ± 0.07*0.63 ± 0.08*#0.77 ± 0.09*#△

3 讨论

高脂饮食可诱发胰岛素抵抗、NAFLD、代谢综合征、2型糖尿病及动脉硬化性心脑血管疾病的发生［8］，严重危害人民的生命健康。NAFLD已成为我国第一大慢性肝病［9］，成为公共健康问题。肝脏的血供有约70%来源于肠道相关血管，肝肠解剖上的关系决定了其功能上的密切联系。近年来，“肠—肝轴”被人们认识和重视，“肠—肝轴”在NAFLD的发病过程中具有重要地位［10］。NAFLD常伴肠黏膜屏障受损［11］，肠黏膜屏障的受损加速了NAFL向NASH、肝纤维化及肝硬化的发展。本研究成功应用高脂饮食诱导了大鼠肝脏脂肪变，大鼠血清LPS水平升高，说明NAFLD大鼠肠黏膜屏障功能受损。

氧化应激是NAFLD时肠黏膜屏障损伤的重要机制［12］。LI等［13］研究发现，高脂饮食可使肠黏膜大量促炎细胞因子产生，诱导肠黏膜氧化应激反应，导致肠黏膜肌球蛋白轻链激酶 （myosin light chain kinase，MLCK）表达升高，紧密连接受损，肠黏膜通透性升高。本研究发现，高脂喂养大鼠肠组织中MDA水平升高、SOD水平降低，说明高脂喂养大鼠肠黏膜存在氧化应激，血浆DAO活性升高，血清LPS水平升高，说明肠黏膜通透性升高，肠黏膜屏障功能受损，与既往研究结果一致。

Nrf2是一种调控机体氧化应激反应的重要的核转录因子［14］，富含亮氨酸拉链结构，属于CNC转录因子家族成员，是体内氧化应激的中枢调控者，在维持体内氧化还原稳态过程中发挥重要作用。生理状态下，Nrf2在胞浆与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1结合而被降解，机体受到亲电体和活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）刺激后，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1解离进入到细胞核，进一步与抗氧化反应元件结合，启动下游抗氧化酶基因表达［15］。HO-1为Nrf2下游重要的保护性蛋白酶［16］。HO-1是一种微粒体酶，可将血红素分解代谢为胆绿素、胆红素、一氧化碳和自由铁，发挥其强大的抗氧化、抗炎作用［17］。本研究中，高脂喂养大鼠由于肠组织氧化应激水平的升高，Nrf2、HO-1的表达较正常对照组增加，这是一种机体在病理情况下的保护性调节行为，这也说明了Nrf2/HO-1在NAFLD时是调控肠道氧化应激的重要信号。

姜黄素有强大的抗氧化、清除自由基的作用［18］。LIN等［19］通过体外细胞培养发现，姜黄素能够激活Nrf2-Keap1信号通路发挥其抗氧化作用。本研究应用姜黄素对高脂喂养大鼠进行干预后发现，大鼠肠组织中MDA水平降低、SOD水平升高，Nrf2、HO-1的表达较模型组显著增加，并且与姜黄素应用的剂量相关，这表明姜黄素激活了Nrf2/HO-1通路。同时姜黄素干预组大鼠，肠源性内毒素血症减轻，小肠黏膜损伤程度明显减轻，肝脏脂肪变程度得到改善。

综上所述，姜黄素灌胃可改善脂肪肝大鼠的肠黏膜屏障损伤，其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路改善肠道氧化应激状态有关。本研究为肝病肠治提供了理论依据，但本研究未以该通路抑制剂进行对照验证，且对其上游信号分子也未进行充分探讨，后期将深入进行相关研究。