EGCG对高脂饮食GK大鼠白色脂肪米色化的诱导作用与机制研究

万丽玮 曾鸿哲 彭丽媛 文帅 刘昌伟 鲍肃都 安勤 黄建安 刘仲华

收稿日期：2023-10-11             修訂日期：2023-11-11

基金项目：国家茶叶产业技术体系（CARS-19）、茶叶功能成分优异资源高效利用技术研究（湘财农指[2021]0015号）

作者简介：万丽玮，女，硕士研究生，主要从事茶叶功能成分利用与深加工研究。*通信作者：Jian7513@hunau.edu.cn；larkin-liu@163.com

摘要：脂肪组织类型与人体代谢密切相关，通过饮食或营养干预将白色脂肪细胞转变为产热的米色脂肪细胞是一种减少脂肪积蓄、调节代谢的安全策略。目前关于白色脂肪组织米色化作用的研究多聚焦于肥胖群体，为探究EGCG对非肥胖代谢紊乱群体的内脏白色脂肪组织米色化的诱导作用及相关机制，采用非肥胖型自发性2型糖尿病模型Goto-Kakizaki（GK）大鼠，给予每日高脂饮食，并进行40 mg·kg-1和80 mg·kg-1 EGCG灌胃干预，检测GK大鼠的体质量、摄食量、脂肪组织细胞形态及米色化相关基因表达水平、UCP1蛋白表达水平，并进行转录组测序。结果表明，80 mg·kg-1 EGCG灌胃干预对GK大鼠摄食量和体质量无明显影响，但能够促使脂肪细胞呈现向多房型脂肪细胞转变趋势，并显著上调米色化相关的Pparg、Ppargc1a、Ucp1基因表达水平和UCP1蛋白表达水平，具有诱导高脂饮食GK大鼠内脏附睾白色脂肪组织米色化的作用，且表现出调节脂质代谢的潜力。结合转录组分析结果表明，EGCG对高脂饮食GK大鼠白色脂肪组织米色化的诱导作用机制可能与PPAR信号通路、PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路有关。

关键词：EGCG；非肥胖型；GK大鼠；白色脂肪组织；米色化

中图分类号：S571.1；R972+.6               文献标识码：A              文章编号：1000-369X（2024）01-119-14

Inductive Effect and Mechanism of EGCG on Beiging of White Adipose Tissue in High-fat Diet-fed GK Rats

WAN Liwei， ZENG Hongzhe， PENG Liyuan， WEN Shuai， LIU Changwei， BAO Sudu，

AN Qin， HUANG Jian'an*， LIU Zhonghua*

Key Lab of Education Ministry of Hunan Agricultural University for Tea Science， National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China， Changsha 410128， China

Abstract： The types of adipose tissue are closely related to human metabolism. Transforming white adipocytes into thermogenic beige adipocytes through dietary or nutritional interventions is a safe strategy to reduce fat accumulation and regulate metabolism. Currently， research on the role of white adipose tissue beiging has mainly focused on obese populations. To explore the effect of EGCG on promoting the beiging of white adipose tissue in non-obese individuals with metabolic disorders and its related mechanisms， this study used non-obese， spontaneously diabetic type 2 GK rats. These rats were fed a high-fat diet and received 40 mg·kg-1 and 80 mg·kg-1 EGCG daily by gavage. In this study， we assessed body weight， food intake， cellular morphology of adipose tissue， gene expression levels associated with beiging， and protein expression levels of UCP1 in GK rats. Additionally， transcriptome sequencing was also performed on epididymal white adipose tissue. The results show that gavage intervention with 80 mg·kg-1 EGCG has no significant effect on the food intake and body weight of GK rats. It induced a trend of beiging in adipocytes towards a multilocular phenotype transformation， characterized by a decrease in cell size and an increase in cell number. Moreover， it significantly upregulated the expression levels of beiging-related genes Pparg， Ppargc1a， Ucp1 and the protein expression level of UCP1.This demonstrates the inducing effect of EGCG on the beiging of visceral epididymal white adipose tissue in high-fat diet-fed GK rats， indicating its potential in the regulation of lipid metabolism. Combined with transcriptome analysis， the results suggest that the induction mechanism of EGCG on the beiging of white adipose tissue in high-fat diet-fed GK rats may be associated with the PPAR signaling pathway， PI3K/Akt， and MAPK signaling pathway.

Keywords： EGCG， non-obesetype， Goto-Kakizaki rats， white adipose tissue， beiging

机体代谢平衡由复杂的内稳态系统维持，涉及多个组织器官，其中，脂肪组织负责多种脂肪因子的合成与分泌，承担着调节新陈代谢、维持能量稳态、保护周围组织等作用，与糖尿病、肥胖、高脂血症等多种疾病的发生密切相关[1]。哺乳动物的脂肪组织分为主要由白色脂肪细胞组成的白色脂肪组织（White adipose tissue，WAT）和主要以棕色脂肪细胞为主的棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT）。在WAT中，白色脂肪细胞用于储存甘油三酯，并且可以被诱导转分化为类似棕色脂肪细胞的米色脂肪细胞，这一过程被称为米色化；在BAT中，棕色脂肪细胞通过线粒体中的解耦联蛋白（Uncouple proteins，UCPs）在非耦联呼吸及能量消耗中发挥重要作用。米色和棕色脂肪细胞都能以热量形式消耗能量，被称为产热细胞[2-3]。WAT的米色化是一个复杂的适应性代谢重塑过程[4]，其诱导生成的米色脂肪细胞不仅能够增强脂质分解代谢、改善胰岛素敏感性，而且表现出卓越的葡萄糖摄取与氧化能力[5-6]。因此，诱导米色脂肪细胞生成被认为是一种对抗代谢紊乱的策略，如何通过饮食或营养干预提高产热脂肪组织的丰度和活性从而促进自身的能量代谢并降低机体的脂质积累，已成为调节代谢、预防代谢性疾病的重要研究方向[7]。

绿茶是世界范围内流行的健康饮料。流行病学和试验研究表明，饮用绿茶可以降低肥胖及相关疾病的风险[8]。绿茶中含有丰富的儿茶素，包括表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）[9]，其中，EGCG是绿茶中主要的生物活性儿茶素，占绿茶儿茶素总含量的50%[10]。据报道，EGCG具有调节饮食诱导肥胖小鼠脂质代谢的作用，并通过提高棕色脂肪组织产热和线粒体生物发生基因的表达改善肥胖[11]；体外试验发现，EGCG抑制了3T3-L1前脂肪细胞分化，并诱导腹股沟白色脂肪组织（Inguinal white adipose tissue，iWAT）米色化[12]，这些结果都提示EGCG可能是白色脂肪细胞转变为米色脂肪细胞的诱导因子。iWAT是小鼠和大鼠的经典皮下脂肪组织，附睾白色脂肪组织（Epididymal white adipose tissue，eWAT）是小鼠和大鼠的经典内脏脂肪组织，它们在发育起源、解剖位置和对代谢刺激的反应方面有所不同[13]，Li等[14]认为EGCG可能通过不同的机制在皮下脂肪组织和附睾脂肪组织中起作用。目前，有关EGCG促进脂肪细胞米色化作用的研究主要采用皮下白色脂肪组织（Subcutaneous white adipose tissue，scWAT），对内脏白色脂肪组织（Visceral white adipose tissue，visWAT）米色化的研究较少，且诱导米色化的机制尚未明确。因此，本研究选取大鼠经典内脏白色脂肪库eWAT为研究对象，探究EGCG诱导visWAT米色化的作用。

Goto-Kakizaki（GK）大鼠是常用的非肥胖型自发性2型糖尿病模型[15]，在断乳（3周龄）后即出现代谢紊乱，高脂饮食会进一步加重GK大鼠糖尿病及其代谢紊乱[16-18]，因此，高脂饮食的GK大鼠被认为是一种经典的代谢紊乱动物模型[15]。目前有关EGCG促进WAT米色化作用的研究主要集中于肥胖群体，但是，非肥胖群体也可能存在代谢性疾病。有研究表明，亚洲人即使在不肥胖的情况下也易患代谢疾病[19]，这些代谢紊乱的非肥胖型群体也有调节代谢和预防代谢性疾病的需求，而通过诱导WAT米色化改善其代谢紊乱是一种有前景的策略。因此，本研究以高脂饮食的GK大鼠为研究对象，通过补充不同剂量的EGCG，研究EGCG对GK大鼠主要的内脏白色脂肪库eWAT米色化的诱导作用，并结合转录组学进一步挖掘EGCG在非肥胖型代谢紊乱群体中visWAT米色化的相关机制，以期为EGCG在非肥胖型代谢紊乱群体中作为一种天然的调节代谢、预防代谢性疾病的活性物质补充理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物

30只SPF级的雄性GK大鼠（9～11周龄）购自江苏常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2021-0013。动物房温度控制在（25±1）℃，光照条件设定为12 h/12 h光暗循环，每笼饲养5只大鼠，每日更换垫料、清洗水瓶以保持笼内清洁，试验期间大鼠自由饮水、摄食。

1.1.2 药品与试剂

EGCG（纯度≥98%）由湖南三福生物科技有限公司提供；甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、非酯化游离脂肪酸（Nonesterified free fatty acids，NEFA）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density

lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；线粒体解偶联蛋白1（Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1，UCP1）兔多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术公司；SteadyPure RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq预混型qPCR试剂盒均购自湖南艾科瑞生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

MS204TS电子天平，梅特勒托利多集团；PCRUV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司；多功能酶标分析仪，深圳市汇松科技发展有限公司；Power Gen125高速匀浆机、ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪、Nanodrop 2000核酸浓度测定仪，赛默飞世尔科技公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；石蜡包埋机，武汉俊杰电子有限公司；Eclipse C1正置荧光显微镜，日本尼康公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物试验设计

30只GK大鼠经适应性喂养2周后随机分为3组，分别为对照组（CON，n=10）、40 mg·kg-1 EGCG干预组（EGCG-L，n=10）和80 mg·kg-1 EGCG干预组（EGCG-H，n=10），每组大鼠均进食60%高脂饲料。其中，EGCG剂量参照Yang等[20]确定的每杯冲泡绿茶的EGCG含量，并根据体表面积归一化[21]方法推算（人体每日饮用绿茶2～3杯相当于大鼠每日灌胃40 mg·kg-1 EGCG；人体每日饮用绿茶4～5杯相当于大鼠每日灌胃80 mg·kg-1 EGCG）。EGCG干预组按照设定剂量灌胃给药，CON组灌胃等量超纯水，每日1次，持续4周，灌胃体积根据每日体重变化而变化。试验期间，每周称量大鼠体质量1次，每两天统计1次摄食量。待试验结束，大鼠禁食12 h，经腹腔按30 mg·kg-1剂量注射戊巴比妥钠麻醉，收集各组大鼠的血液样本和附睾白色脂肪组织（Epididymal white adipose tissue，eWAT），置于–80 ℃保存备用。本试验符合动物伦理规范并经湖南农业大学动物实验委员会批准，批准号：伦审科2021第（2137）号。

1.2.2 大鼠脂肪组织切片病理学观察

取每只大鼠的附睾脂肪组织于4%多聚甲醛溶液中固定，经脱水、包埋、切片后制备成石蜡切片，进行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-

eosin staining，H&E染色），将切片置于显微镜下观察并拍照。

1.2.3 实时荧光定量PCR

按照试剂盒说明，提取脂肪组织RNA，通过逆转录反应合成cDNA。以cDNA为模板，按试剂盒说明书要求进行实时荧光定量PCR反应，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。采用β-actin作为内参基因，对脂肪组织中UCP1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂-1α（Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PPARGC1A）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）的基因表达水平进行检测，3次技术重复。使用NCBI Primer-BLAST网站（www.ncbi.nlm.

nih.gov/tools/primer-blast）设计引物，委托北京擎科生物科技股份有限公司进行引物合成，PCR引物序列见表1，采用法分析基因的相对表达量。

1.2.4 脂肪组织UCP1蛋白表达水平检测

免疫组织化学检测脂肪组织UCP1蛋白表达水平。将石蜡切片脱蜡脱水，进行抗原修复，用牛血清白蛋白室温封闭后，滴加UCP1一抗4 ℃孵育过夜，第二天滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育，待二氨基联苯胺显色后使用苏木素复染，最后将切片脱水、透明、封片后，将玻片置于扫描仪下采集图像。

1.2.5 血液生化指标检测

大鼠麻醉后主动脉取血，将采集的血液样本在4 ℃、3 500 r·min-1条件下离心10 min，收集上层血清，放置于–80 ℃冰箱中保存备用。按照试剂盒说明书，使用多功能酶标分析仪测定血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、NEFA的含量。

1.2.6 总RNA提取与转录组测序

使用总RNA提取试剂盒分别提取每只大鼠附睾白色脂肪组织的RNA，使用Nanodrop 2000核酸定量分析仪对所提RNA的浓度及纯度进行检测，OD260/280在1.9～2.1，OD260/230≥1.0的视为合格，样品检测合格后，委托深圳华大基因科技有限公司进行脂肪组织RNA的测序，每组设置3个生物学重复。

1.2.7 测序数据处理与分析

将测序得到的raw data使用深圳华大基因科技有限公司自主研发的过滤软件SOAPnuke（v1.5.6）进行过滤，过滤掉包含接头、未知碱基N含量大于5%、低质量的（质量值低于15的碱基占该reads总碱基数的比例大于20%的reads为低质量的reads）reads，得到clean data。使用Dr. Tom多组学数据挖掘系统（https：//biosys.bgi.com）进行数据分析、绘图及挖掘。通过HISAT2（v2.1.0）软件将clean data与参考基因组进行比对，使用Bowtie2（v2.3.4.3）将clean data比对到参考基因集上并在RSEM（v1.3.1）软件进行基因表达定量。通过pheatmap（v1.0.8）绘制基因表达量的聚类热图，使用DESeq2（v1.4.5）進行差异基因检测，条件为Q值≤0.05且|log2Fold Change|≥0.585。基于超几何检验深入探索与表型变化相关的基因功能，使用Phyper对差异基因进行GO及KEGG（www.kegg.jp）富集分析，以Q值≤0.05为阈值筛选显著富集的候选基因。使用GSEA（v4.3.2）软件进行基因集富集分析，满足校正后P值（Adjusted P value）<0.25的视为显著富集。

1.2.8 数据处理

所有试验数据均使用平均数±标准差（±SD）表示，采用Image J软件处理图像，使用GraphPad Prism 9和TBtool软件对试验数据进行处理分析及图表绘制，多组间数据比较采用One-way ANOVA单向方差分析和Tukey

事后检验，当P<0.05时表示差异达到统计学显著水平，*、**、***、****分别表示P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1。

2 结果与分析

2.1 EGCG对高脂饮食GK大鼠体质量和摄食量的影响

由图1A可知，适应性喂养两周后，30只GK大鼠的体质量无显著差异，经相应条件饲养4周后，各组GK大鼠的体质量无显著差异。对GK大鼠每日摄食量进行分析发现，与CON组相比，EGCG干预对GK大鼠摄食量无显著影响（图1B）。以上结果表明，在本试验中EGCG灌胃干预对GK大鼠体质量与摄食量影响不显著。

2.2 EGCG对高脂饮食GK大鼠脂肪组织形态的影响

由图2可知，CON组脂肪细胞体积膨大，且严重变形，细胞大小不一，呈无规则排列（图2A）；EGCG-L组脂肪细胞排列相对整齐，无明显变形，结构较完整（图2B）；EGCG-H

组脂肪细胞呈多边形，视野内可见细胞数目增多，且细胞排列整齐，形态清晰，细胞膜清楚（图2C）。每个切片随机选取5个视野，使用Image J软件对视野范围内的每个脂肪细胞面积进行定量分析，结果如图2D所示。相对于CON组，EGCG-L组和EGCG-H组细胞平均面积显著下降（P<0.01），且EGCG干预组的脂肪细胞面积的数值分布较CON组更集中，此外，EGCG-H组细胞面积的最大观测值与最小观测值均小于其他两组。

2.3 EGCG对高脂饮食GK大鼠脂肪组织米色化相关基因表达的影响

为进一步探究EGCG对高脂饮食GK大鼠白色脂肪组织米色化的诱导作用，检测了脂肪组织中调控脂肪细胞分化的关键基因Pparg以及产热基因Ucp1、Ppargc1a的表达情况。如图3所示，与CON组对比，EGCG-L组Pparg表达量显著上升（P<0.05），Ppargc1a和Ucp1表达量无显著差异；EGCG-H组Pparg、Ppargc1a、Ucp1表达量均极显著上升（P<0.01）。

2.4 EGCG对高脂饮食GK大鼠UCP1蛋白表达水平的影响

线粒体棕色脂肪解偶联蛋白1（Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1，UCP1）是在产热脂肪细胞中特异性表达的蛋白，是研究脂肪组织产热功能的重要标志物。白色脂肪细胞被诱导为米色脂肪细胞后会激活UCP1蛋白的表达，为明确EGCG对高脂饮食GK大鼠UCP1蛋白表达水平的影响，进一步通过免疫组织化学检测了UCP1蛋白在GK大鼠eWAT的表达情况。由图4可知，CON组和EGEG-L组细胞染色少且呈淡黄色，UCP1蛋白均呈弱阳性表达，EGCG-H组细胞染色为棕黄色，UCP1蛋白呈阳性表达。使用Image J软件计算平均光密度值，分析UCP1蛋白表达水平，结果如图4D所示，EGCG-L组UCP1蛋白表达水平与CON组无显著差异，EGCG-H组UCP1蛋白表达水平显著高于CON组（P<0.05）。表明40 mg·kg-1 EGCG干预对eWAT米色化作用不明显，而80 mg·kg-1 EGCG干预能够提高产热脂肪标志物UCP1蛋白的表达水平，进一步证明了EGCG能够在eWAT中发挥其诱导白色脂肪组织米色化的作用。

2.5 EGCG對高脂饮食GK大鼠血清脂质水平的影响

为探究EGCG诱导的WAT米色化对脂质代谢的调节潜力，对GK大鼠血脂的重要组分TC、TG、HDL-C、LDL-C进行了检测。由图5A和5B可知，与CON组相比，EGCG-H组血清TG、TC水平显著下降（P<0.01）。高水平的LDL-C是动脉粥样化及心血管疾病重要的发病因素，图5C显示，与CON组相比，EGCG-L和EGCG-H组大鼠血清LDL-C水平均得到显著改善（P<0.05），且EGCG-H组效果优于EGCG-L组。血清中HDL-C有助于降低心脑血管疾病的发病风险，其水平和动脉粥样硬化的发生、发展呈负相关[18]，由图5D可知，EGCG-L组HDL-C水平显著高于CON组（P<0.01），而EGCG-H组与CON组无显著差异。NEFA是血清中未与胆固醇、甘油等成分酯化的非酯化游离脂肪酸，其水平可反映脂质代谢状况。由图5E可知，与CON组相比，EGCG-L组NEFA含量下降，但无显著差异，而EGCG-H组NEFA含量显著降低（P<0.05）。以上结果表明，40 mg·kg-1和80 mg·kg-1 EGCG干预能不同程度地改善脂质代谢，其中，80 mg·kg-1 EGCG干预能够显著影响血脂水平。

2.6 EGCG对高脂饮食GK大鼠脂肪组织转录组的影响

本研究通过DNBSEQ平台检测了GK大鼠eWAT共9个样品，单个样品平均产出6.68 G数据。样品比对基因组的平均比对率为98.15%，比对基因集的平均比对率为72.31%。为确保试验数据准确，对转录组测序所得的原始数据（Raw reads）进行过滤，得到高质量clean reads，数据过滤情况如表2所示。过滤后的clean reads占原始数据的比例大于95%，Q20和Q30分别代表测序过程中碱基识别错误的概率小于1%和0.1%的clean reads的比率，由表2可知，本研究中所有被测样品的clean reads Q30均在94%以上，测序质量较高，能够满足后续测序数据分析的要求。

将样本基因表达量降维处理后进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），结果如图6A所示，3组样本的组内聚类和组间差异符合进一步分析的要求。如图6B和6C所示，在CON组和EGCG-L组之间共筛选到55个差异表达基因，其中27个差异基因上调表达，28个差异基因下调表达；在CON组和

EGCG-H组之间共筛选到323个差异表达基因，其中127个差异基因上调表达，196个差异基因下调表达，差异基因表达量热图如图6D所示。利用KEGG数据库对差异表达基因进行生物学途径分类，结果如图6E和6F所示，EGCG-L组的差异表达基因更多富集在免疫系统相关通路，在代谢途径中富集到的通路数量较少，而EGCG-H组的差异表达基因更多富集在脂质代谢和内分泌系统相关通路。进一步对CON组和EGCG干预组的差异表达基因进行KEGG富集，富集结果如图6G和6H所示，与CON组相比，EGCG-L组差异基因显著富集在补体和凝血级联、类风湿性关节炎、近端小管碳酸氢盐回收、肌动蛋白细胞骨架的调节、蛋白质消化和吸收、白细胞经内皮迁移信号通路；EGCG-H组差异基因显著富集在ECM-受体相互作用信号通路、TGF-β信号通路、神经退行性病变-多种疾病信号通路、河马信号通路、色氨酸代谢、阿米巴病、人瘤病毒感染、基底细胞癌、Wnt信号通路、MAPK信号通路、癌症中的转录失调、雌激素信号通路、生热作用、糖尿病心肌病、PI3K/Akt信号通路、PPAR信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、癌症中蛋白聚糖、金黄色葡萄球菌感染、亨廷顿病信号通路。

由于KEGG富集分析涉及到主观设定的阈值，可能遗漏部分有重要生物学意义的基因，并且不能反映差异基因的总体变化趋势，具有一定局限性，因此，进一步将EGCG-H组对比CON组进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA），结果如图7所示。GSEA显著富集到PPAR信号通路、AMPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路，其中PPAR信号通路被活化，AMPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路被抑制。此外，对EGCG-H组的米色脂肪细胞标志基因Ucp1、Dio2、Cox8b、Ppargc1a、Tmem26以及Fgf21、Sorl1、Fndc5等可能与EGCG发挥促进WAT米色化作用相关基因的

表达量进行分析，结果发现（图6E），相对于CON组，EGCG-H组Sorl1表达量下调，Ppargc1a、Cox8b、Dio2、Fgf21、Ucp1、Fndc5、Tmem26表达量上调，表明这些基因可能与EGCG促进eWAT米色化有关。

3 讨论

绿茶是一种有益健康的饮品，越来越多的研究表明，饮用绿茶与预防心血管疾病和改善机体代谢有关，在绿茶中含量最丰富的儿茶素EGCG的抗肥胖作用已被认可，但对于非肥胖的代谢紊乱动物模型的调节脂质代谢与诱导WAT米色化的作用及其相关机制仍需进一步探究。Grove等[22]研究发现，EGCG能够显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重，但本研究结果显示各组GK大鼠体重均无显著差异，与Uchiyama等[23]使用GK大鼠作为动物模型的结果一致，推测可能是由于GK大鼠的品种特性所致。

脂肪细胞的大小和数量对代谢功能有着重要的影响，脂肪细胞肥大会损害系统的能量平衡[24]，而通过减少能量积累或增加脂肪细胞的数量能够防止脂肪细胞肥大，从而维持脂肪组织的健康[25]，本研究发现，EGCG干预可有效减少脂质积累，经80 mg·kg-1 EGCG干预后，细胞形态发生明显改变，白色脂肪细胞内脂滴变小、数量增多，具有由单房大脂滴过渡到多房小脂滴的米色化趋势，表明EGCG可能通过促进eWAT白色脂肪细胞米色化消耗脂肪组织中过量的能量，达到减少脂质积累的目的。

Pparg是调节脂肪发育和功能，以及白色脂肪细胞向米色脂肪细胞转化的关键转录因子[5]，Ppargc1a、Ucp1是米色脂肪细胞的标志基因[26]。本研究检测结果表明，80 mg·kg-1 EGCG能够显著提高Pparg、Ppargc1a、Ucp1的表达水平。WAT米色化的特点是出现UCP1蛋白的表达[27]，UCP1是一种存在于棕色和米色脂肪细胞线粒体内膜中的蛋白，能够消耗线粒体内外膜间的质子电化学梯度，使氧化磷酸化与ATP合成解偶联，把底物氧化产生的能量转化为热能，以此介导脂肪组织产热，发挥预防代谢性疾病的作用[28]。虽然近年来有研究证明存在不依赖于UCP1的生热途径[29]，但线粒体中ATP合成的解偶联仍然是棕色和米色脂肪细胞产热的主要机制。为进一步探究产热脂肪标志物UCP1蛋白的表達，对eWAT进行免疫组织化学检测，结果表明，80 mg·kg-1 EGCG干预能够激活脂肪分化相关的重要转录因子Pparg及其共激活物Ppargc1a，增强PPARG与PPARGC1A的结合，进而使线粒体膜的特异性蛋白UCP1的表达增加，使白色脂肪细胞转化为米色脂肪细胞。

WAT的米色化伴随着代谢重编程，具有促进脂肪分解代谢和能量消耗的作用，被视为对抗代谢紊乱的有效策略[5]。本研究结果表明，40 mg·kg-1 EGCG干预能够调节高脂饮食GK大鼠血清LDL-C、HDL-C水平，80 mg·kg-1 EGCG干预能够调节血清TG、TC、LDL-C、NEFA水平，两个不同剂量的EGCG都能在不影响摄食量和体质量的情况下，表现出调节脂质代谢的潜力，且80 mg·kg-1剂量EGCG的效果更显著，这可能是WAT米色化带来的代谢收益。

为揭示EGCG对高脂饮食GK大鼠WAT米色化的诱导作用及机制，我们对GK大鼠eWAT进行了转录组测序，发现经不同剂量的EGCG干预后，EGCG-H组相较于EGCG-L组筛选到了更多的差异基因，与CON组的差异更为明显。通过KEGG富集发现，EGCG-L组的差异表达基因未显著富集到与脂肪产热调控有关的信号通路，而EGCG-H组的差异表达基因显著富集到TGF-β信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、PPAR信号通路、PI3K/Akt信号通路和生热作用，这些通路被认为与脂肪生成、脂肪分化、产热调控有关。由于KEGG富集分析是针对有显著差异的基因进行富集，可能遗漏部分有重要生物学意义的基因。从基因集角度将EGCG-H组对比CON组进行GSEA富集分析发现，经80 mg·kg-1 EGCG干预后，大鼠PPAR信号通路被活化，AMPK信号通路、PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路被抑制。PPAR信号通路在糖脂代谢和脂肪产热等方面发挥了重要作用，许多PPAR激动剂已被合成用于治疗血脂异常和2型糖尿病等代谢性疾病[30]，PPAR信号通路的激活能够促进WAT米色化；AMPK是调控脂质合成代谢与分解代谢的关键上游因子，激活AMPK信号通路可以调控脂质代谢紊乱[31-32]。但本研究发现，经EGCG干预后AMPK信号通路在大鼠eWAT中受到抑制，这可能与GK大鼠代谢特性有关。成年（8～12周）GK大鼠胰岛β细胞数量明显减少且分泌功能受损，在疾病后期（8～24周）胰岛炎症反应的急剧增强，伴随胰岛功能性代偿机制的丧失[33-34]，研究表明，EGCG能有效控制胰岛炎症[35]，保护和改善胰岛β细胞功能[36]，Orts?ter等[37]发现，EGCG能改善db/db小鼠的糖耐量，增加胰岛素分泌并且减少胰岛的病理改变，近期研究证实AMPK与胰岛素信号通路间存在复杂的关系，胰岛素能够抑制AMPK的活性[31]，因此，我们推断AMPK信号通路的抑制可能与EGCG对GK大鼠胰岛β细胞的保护和促进胰岛素分泌的作用有关。PI3K能够被免疫细胞中的细胞因子和趋化因子受体激活，参与炎症细胞的募集，抑制PI3K/Akt信号通路能够减少脂肪组织的巨噬细胞浸润[38]。另有研究表明，抑制PI3Kα可能促进β3-肾上腺素能信号传导，诱导WAT米色化从而增加能量消耗[39]。内脏脂肪组织在受到高脂饮食等诱导肥胖刺激后，相较于皮下脂肪组织更易产生炎症反应[40]，抑制MAPK信号通路能够减少巨噬细胞中炎症细胞因子的表达[41]，本研究中，EGCG干预抑制了高脂饮食GK大鼠eWAT的MAPK信号通路，这可能与EGCG的抗炎作用有关，Okla等[42]认为抗炎作用有助于提高产热脂肪细胞的活性。

針对EGCG-H组的米色脂肪细胞标志基因和米色化作用相关基因的表达量分析发现，相对于CON组，EGCG-H组Ppargc1a、Cox8b、Dio2、Ucp1、Tmem26表达量上调，这些基因是米色脂肪细胞特异性基因[43-44]，其表达量的上调进一步佐证了EGCG在大鼠eWAT中诱导米色化的作用。Whittle等[45]研究发现Sorl1敲除的小鼠出现白色脂肪组织米色化且不受饮食诱导肥胖的影响；Laeger等[46]认为FGF21能够在不改变小鼠体脂肪量的情况下诱导WAT褐变和增强产热作用；由Fndc5编码的鸢尾素是一种运动诱导的肌动蛋白，具有诱导WAT褐变、改善胰岛素抵抗等生物学作用[47]。本研究发现，相较于CON组，EGCG-H组Sorl1表达量下调，Fgf21、Fndc5表达量上调，这些基因可能是EGCG诱导GK大鼠eWAT米色化作用的潜在靶点，后续将通过RNA干扰技术、基因敲除技术、蛋白质组学等方法对其作用机制进行进一步探究。

本研究从GK大鼠的体质量、摄食量、脂肪细胞形态、白色脂肪组织米色化相关基因表达水平、UCP1的蛋白表达水平以及eWAT RNA-seq对EGCG在GK大鼠visWAT米色化的诱导作用进行了多方面的探究，但未涉及脂肪细胞的线粒体功能的研究。WAT米色化过程中脂肪细胞为满足细胞的产热需求，其线粒体数量和活力均会大幅增加[2]，未来可以从线粒体生物发生、融合分裂与自噬以及蛋白稳态等方面对EGCG促进WAT的米色化作用进行更深入的研究。

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