基于转录组学数据探讨针刺“足三里”或“内关”改善溃疡性结肠炎的腧穴功效差异＊

董龙聪，张瑞斌，沈 缘，李虹莹，黄 琴，余曙光，吴巧凤

（成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610075）

传统中医理论认为，腧穴功效除具有相对特异性外，同时还具有整体调节效应，表现出一定的共性特点。例如，足三里是下合穴，其主要功能是调理胃肠道功能，但在治疗心血管类疾病时，足三里也是一个高频使用的穴位[1]；内关是手厥阴心包经之络穴，其功能主要是宁心安神、理气止痛，但治疗胃肠道疾病时，由于是八脉交会穴，也会调气机，安脾胃[2]。因此古人将这两个腧穴的特异性功效概括为“合治内腑”或“内关心胸谋”，而又将其功效的多面性概括为“足三里诸病皆治”或“内关可活一身之血脉瘀滞”。但是，这些论述背后具体的现代原理及其相关生物学机制还不清楚。20世纪70年代以来，研究者在动物身体上的不同区域进行刺激，可以特异性地诱导自主神经反射调节机体功能，如针刺“足三里”穴位能通过迷走神经介导作用促进胃肠运动，而针刺刺激腹部“天枢”穴位能抑制胃肠运动（交感神经介导为主）。2020 年，研究证实，用电针刺激足三里和天枢穴都能缓解小鼠的炎症因子风暴，但足三里只需要用0.5 mA 的低强度刺激就能激活从迷走神经到肾上腺的抗炎通路，起到治疗效果，而且无论是患病前预先刺激还是患病后再刺激，都有正面效果；但低强度刺激天枢穴无法激活以上抗炎通路，必须达到1-3 mA 的高强度刺激才能通过激活交感神经通路发挥抗炎作用[3]。后续有研究指出，是否表达Prokr2 基因的背根神经节（Sorasal root ganglion，DRG）感觉神经元是造成足三里和天枢穴上述不同抗炎结局的重要机制，从神经解剖学角度为穴位的相对专一性或特异性做出了进一步的科学解释[4]。结合上述研究的结论不难发现，足三里和内关两个穴位由于均分布在机体四肢，因此具有一定的共性，同时由于它们分别与迷走神经和交感神经关系密切，在功效上可能又各有特点，但是两者在功效的微观层面上到底有何差异，其功效特点与病变部位是否有关联等问题仍然值得进一步研究。因此，本研究将利用转录组测序技术，以硫酸葡聚糖钠盐（Dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）小鼠模型为载体，研究针刺“足三里”或“内关”对于病变部位结肠及非病变部位心脏的基因变化，从病变和非病变组织的转录组学等生物信息学角度，为阐释两个腧穴功效的相似性和差异性提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

无特定病原体级雄性C57BL/6J 小鼠36 只，体质量26±2 g，均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司（动物生产许可证号：SCXK（川）2020-034）。动物饲养于小鼠独立通气笼盒，室温23±2℃，12 h 明暗交替，小鼠自由饮食、饮水。本实验已获得成都中医药大学伦理委员会的批准（2019-04），并严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定进行实验操作。

1.2 主要试剂与仪器

DSS（9011-18-1，MP Biomedicals），联苯胺（92-87-5，上海阿达玛斯试剂有限公司），一次性针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司），4%多聚甲醛通用型组织固定液（G1101，武汉赛维尔生物科技有限公司），苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）（G1076，武汉赛维尔生物科技有限公司），全长转录组测序平台（英国Oxford Nanopore Technologies），2015 石蜡切片机（德国Leica），HS6 病理切片扫描仪（舜宇光学科技（集团）有限公司）。

1.3 造模与干预方法

C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后随机分为空白组9 只、造模组27 只。通过自由饮用2.5%浓度的DSS 7天的方式对造模组进行造模[5]。判定造模成功的方法为：造模第5天，对比观察空白组与造模组小鼠体质量下降情况，采集两组小鼠新鲜粪便，比较粪便情况，根据联苯胺隐血检测说明，比较两组小鼠粪便隐血情况。以小鼠出现体质量下降、粪便松散或稀便及粪便隐血试验阳性为造模成功的标准[6]。在第5 天按照体质量区间分组法随机分为模型组、足三里组和内关组。足三里组及内关组从造模第5 天开始进行干预，模型组和空白组只捆绑固定，不予其它干预。依据《实验针灸学》[7]中“常用动物穴位及图谱”的小鼠“足三里”和“内关”定位进行针刺干预。具体方法为：足三里穴位于膝关节下方，腓骨小头下0.3 cm 处的肌沟中；内关穴位于前肢内侧，腕关节上方0.3 cm 处的桡、尺骨间。分别于上述穴位针刺至肌层，留针30 min，每天1次，连续针刺干预5天。

1.4 观察指标及检测方法

小鼠一般状态观察、DAI 评分[6]：每日记录小鼠体质量变化，并观察各组小鼠的自主活动、毛发色泽及精神状态变化。每次干预结束后，采集各组小鼠新鲜粪便观察粪便质地、性状并检测粪便隐血。同时，依据DAI计算公式，计算各组的DAI评分。

HE 染色观察各组小鼠结肠组织形态学变化：干预结束后，将各组小鼠脱颈处死，截取盲肠远端到肛门1 cm 的全部肠段。生理盐水冲洗肠内容物后，放置于4%多聚甲醛组织固定液中固定48 h。常规石蜡包埋切片，厚度4 µm，二甲苯脱蜡，乙醇梯度洗脱，HE染色，封片，病理切片扫描仪扫描。

全长转录组测序：干预结束后，取小鼠新鲜结肠及心脏组织经液氮速冻后，置于干冰中送至北京百迈客生物科技有限公司进行全长转录组测序分析。实验流程按照Oxford Nanopore Technologies 公司提供的标准步骤执行：提取总RNA，合格样品上机检测，通过引物扩增、退火，反转录成cDNA，通过switch oligo，合成互补链，DNA 损伤修复和末端修复，磁珠纯化等步骤完成文库构建并连接测序接头，上机测序。

生物信息学分析：使用“DESeq2”包分析各组间的差异表达基因（Differential expressed genes，DEGs），DEGs 的筛选条件为|log2（fold change）|>2，P<0.01[8]。使用基因本体论（Gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库进行功能富集分析[9-11]。

1.5 统计学处理

采用R 3.6.3 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。DAI 评分采用Kruskal-Wallis Test，组间两两比较选用Dunn's Test。以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺干预效应观察

2.1.1 各组小鼠一般状态和DAI评分比较

造模开始后小鼠精神逐渐变差，毛发无光，进食少，体质量明显减轻，于第3 天开始陆续出现肛门污秽，可见血便，粪便隐血试验为阳性；针刺足三里或内关后，两组小鼠均较模型组精神状态好，进食逐渐增多，体质量恢复，粪便隐血实验由阳性转为弱阳性或阴性。DAI 评分显示，模型组DAI 评分明显高于空白组（P<0.001），差异有统计学意义；与模型组相比，足三里组及内关组DAI 评分明显降低（P<0.05），差异有统计学意义，且足三里组与内关组组间差异无统计学意义（P>0.05）（见图1）。

图1 各组干预后DAI评分比较（±s，n=9）

2.1.2 各组小鼠结肠组织形态比较

HE 染色结果显示，空白组小鼠结肠上皮结构完整，杯状细胞数量丰富且无炎性细胞浸润。模型组结肠上皮结构破坏明显，杯状细胞大量减少并伴有炎性细胞的大量浸润。足三里组、内关组较模型组结肠损伤均有明显改善（见图2）。

图2 各组小鼠结肠组织形态结构比较（HE染色，×100倍）

2.2 结肠组织RNA-Seq结果分析

2.2.1 差异基因分析

与空白组相比，模型组有1420个基因上调，796个基因下调；足三里组对比模型组有537 个基因上调，770 个基因下调；内关组对比模型组有650 个基因上调，945 个基因下调。聚类结果显示，各组的整体基因表达模式有明显差异（见图3）。

图3 各组样本差异基因的火山图和聚类热图（n=3）

为了进一步分析针刺“足三里”“内关”对于DSS模型干预后基因表达差异，对模型组vs.空白组、足三里组vs.模型组的差异基因取交集，获得具有相反表达趋势的共表达基因993 个。类似地，对模型组vs.空白组、内关组vs.模型组的差异基因取交集，获得具有相反表达趋势的共表达基因1150 个。进一步将上述两个基因集进行Venn分析，筛选出有相同表达趋势差异基因（Common differential expressed genes，co-DEGs）共825 个，足三里组特有差异基因（ST36 only differential expressed genes，ST36 only-DEGs）共168个，内关组特有差异基因（PC6 only differential expressed genes，PC6 only-DEGs）共325个（见图4）。

图4 差异基因Venn图

2.2.2 差异基因富集分析

为了进一步明确co-DEGs、ST36 only-DEGs 及PC6 only-DEGs 三个基因集的功能异同，对其进行了GO 富集分析。结果发现，针刺两个穴位的co-DEGs主要富集到与炎症相关的白细胞迁移、细胞趋化性等条目，反映了针刺两个穴位均具有一定程度的抗炎作用。但分开来看，针刺两个穴位影响的生物过程存在差异（见表1）。

表1 不同针刺干预方式后各组差异基因GO富集分析结果（结肠组织）

接下来，在KEGG 通路富集分析中，co-DEGs富集到IL-17 信号通路、TNF 信号通路、细胞因子和细胞因子受体的相互作用等通路；ST36 only-DEGs 富集到紧密连接、钙信号通路、cAMP 信号通路、磷酸肌醇代谢等通路；PC6 only-DEGs 富集到细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT 信号通路等。为了更全面地分析三个基因集在KEGG 通路富集上的区别，将三个基因集富集到的KEGG 通路进行归类，结果发现在co-DEGs 的KEGG 通路富集归类中，人类疾病中的感染性疾病占比最高（28.57%），同时免疫系统也具有较高的占比（23.81%）。ST36 only-DEGs 的KEGG 通路富集归类分析结果显示最主要改变的通路类型为免疫系统（26.67%）及内分泌系统（20%）。PC6 only-DEGs 的KEGG 通路富集归类分析结果显示最主要改变的通路类型是信号转导通路（38.46%）。同时，使用 Cytoscape 中的ClueGO 筛选三个差异基因集中的核心KEGG通路，co-DEGs筛选出的核心通路包括IL-17信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、Toll 样受体信号通路等，ST36 only-DEGs 筛选出的核心通路包括胃酸分泌、磷酸肌醇代谢等，PC6 only-DEGs 筛选出的核心通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、HIF-1信号通路等（见图5）。

图5 各组差异基因KEGG富集分析

2.3 心脏组织RNA-Seq结果分析

2.3.1 差异基因分析

与空白组相比，模型组有224 个基因上调，203 个基因下调；足三里组对比模型组有137 个基因上调，108 个基因下调；内关组对比模型组有138 个基因上调，151 个基因下调。聚类结果显示，各组的整体基因表达模式有明显差异（见图6）。

图6 各组样本基因的火山图和聚类热图（n=3）

为了进一步分析针刺“足三里”“内关”对于DSS模型干预后基因表达差异，对模型组vs.空白组、足三里组vs.模型组的差异基因取交集，获得具有相反表达趋势的共表达基因123个。类似地，对模型组vs.空白组、内关组vs.模型组的差异基因取交集，获得具有相反表达趋势的共表达基因209个。进一步将上述两个基因集进行Venn 分析，筛选出co-DEGs 共95 个，ST36 only-DEGs共28个，PC6 only-DEGs共114个（见图7）。

2.3.2 差异基因富集分析

为了进一步明确co-DEGs、ST36 only-DEGs 及PC6 only-DEGs 三个差异基因集的功能异同，对其进行了GO 富集分析。结果显示，在心脏中，针刺两个穴位的co-DEGs 主要富集到与炎症相关的防御反应等条目，一定程度反映了针刺两个穴位正在非病变部位仍发挥了抗炎功能。但分开来看，针刺两个穴位影响的生物过程有一定的区别（见表2）。

表2 不同针刺干预方式后各组差异基因GO富集分析结果（心脏组织）

接下来，在KEGG 通路富集分析中，co-DEGs富集到TNF 信号通路、IL-17 信号通路等；而ST36 only-DEGs 未能富集到通路；PC6 only-DEGs 则富集到蛋白质消化吸收、金黄色葡萄球菌感染等通路。为了更全面地分析三个基因集在KEGG 通路富集上的区别，将三个基因集富集到的KEGG 通路进行归类。发现在co-DEGs 的KEGG 通路富集归类中，人类疾病中的感染性疾病占比最高（36.36%）。PC6 only-DEGs 的KEGG 通路富集归类分析结果显示人类疾病中的感染性疾病也有较高的占比（18.42%），此外还发现了心血管疾病相关的通路被富集（2.63%）（见图8）。

图8 各组差异基因KEGG富集分析

将上述结果进一步归纳整理，可以看出无论是针刺足三里还是内关，其对结肠组织的主要影响涉及感染和免疫系统，包括白细胞迁移、炎性相关的IL-17、TNF、Toll 通路等，对心脏组织的主要影响仍然与炎症和提高机体防御反应相关；但是在这种共性基础上，针刺足三里对结肠组织的影响还涉及趋化因子活性、钙信号通路、磷酸肌醇代谢等与内分泌系统相关的通路，针刺内关穴与信号转导通路更为密切，而对非病变组织心脏而言，针刺足三里没有富集到其它核心基因，而针刺内关虽然富集到与心血管相关的核心基因，但也只有不足3%的比例（见表3）。

表3 不同组织基因富集结果归纳表

3 讨论

本研究的目的是探讨不同腧穴功效是否存在特异性和共性。以往大量的研究表明，腧穴功效存在相对特异性，“合治内腑”和“内关心胸谋”等临床经验的总结，一定程度上反映了腧穴功效的特异性，这也是临床合理选穴和提升疗效的重要基础。但是不难发现，除了这种特异性，对机体整体或综合性的调节也是针灸作用的一大特点，是针灸发挥“多靶点、多层次、多水平”综合作用的基础。因此，深刻认识腧穴功效所具有的相对特异性和复杂多样的整体调节作用就成为揭示针灸作用基础的重要途径。现代生物学技术，如系统生物学以及各种组学技术的发展，为我们从宏观与微观相结合的角度揭示腧穴功效的特点提供了便利。在DSS 造模的UC 小鼠模型中，一般认为不会对心脏组织造成损伤（非病变部位）。同时，代谢组学研究[12]显示DSS 诱导的UC 模型对心脏代谢功能存在一定程度的影响，这可能也是本研究中转录组学发生变化的主要原因。因此，通过比较不同腧穴（足三里与内关）对于溃疡性结肠炎治疗中的病变部位（结肠）和非病变部位（心脏）所产生的不同变化并探讨腧穴功效异同的潜在机制。本研究采用转录组学测序的方法对针刺足三里与内关影响UC 小鼠结肠和心脏组织进行了较为细致的比较研究，初步发现：①针刺两个穴位均能改善UC 小鼠的一般状况和结肠炎性症状；②从转录组测序分析结果来看，针刺足三里和内关无论对病变组织结肠，还是对非病变组织心脏均存在较多的共性调节基因，主要富集在免疫、抗炎等方面；但与非病变组织相比，无论针刺哪个穴位都对病变组织的影响更大，共变基因更多，富集到的抗炎相关通路也更多；③对病变组织，针刺足三里和内关均涉及感染和免疫系统，但足三里组主要影响的是免疫和内分泌相关的基因和信号通路，而内关组主要影响的是信号转导通路，两者有细微差别。

《灵枢经》言“合治内腑”[13]，指出下合穴对于相应脏腑有特异性的靶向治疗作用。足三里为胃之下合穴，故有“邪在脾胃……皆调于三里”阐释了足三里对于胃腑疾病的特殊治疗作用[13]。又因“大肠、小肠，皆属于胃”，故足三里的特效作用不仅仅拘泥于胃腑疾病，如“肠中寒，胀满，善噫……三里主之”“霍乱遗矢气，三里主之”等条文所述，胃肠二腑位置相近、功能相关，且经脉相连、经气相通，所以足三里对于肠腑疾病也具有靶向作用[13-14]。内关作为手厥阴心包经络穴，“诸邪之在于心者，皆在于心之包络”，心与心包原为一体，脉气相通，因心“其脏坚固,邪弗能容也”，心包代心受邪，故内关主治心系疾病[13]。“心系实则心痛，虚则为烦心，取之两筋间也”则强调了内关对心脏病变具有靶器官治疗效应[13]。此外，内关为八脉交会穴，通阴维脉，而阴维脉与冲脉通过足太阴脾经、足阳明胃经和足少阴肾经的连属关系，相合于胃、心、胸部，疏利三焦气机，故也常常用于胃肠消化疾病的治疗[15]。相关研究也证实内关可以有效降低胃肠道疾病的炎症反应，降低胃肠道敏感性以改善胃肠功能[16-17]。上述中医理论为足三里或内关治疗胃肠道疾病提供了依据，与临床实践也非常相符。本研究从转录组测序的角度，初步证实了针刺“足三里”与“内关”在DSS 诱导的UC 小鼠模型均能通过调整机体的细胞因子、趋化因子发挥对UC 抗炎“同”的功效。而“足三里”在结肠组织中具有特异性调整作用，“内关”在心脏组织中对于心血管具有靶向作用，这一定程度体现了二穴对于靶器官的“异”的功效。

综上，本研究从转录组学角度证实腧穴功效除具有相对特异性外，同时还表现出一定的共性特点。但是，本研究仅仅从针刺的末端（即效应器官）入手，并没有涉及上游神经支配或中枢调控等路径，未来还需要对产生腧穴功效“同”与“异”的具体机制进行深入的研究。