苜蓿提取物不同极性部位抗氧化活性研究

李倩，孙勇康，安琼，王贞香，张振，梁艳婷

河西学院医学院，甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室（张掖 734000）

自由基是机体内正常的物质代谢所产生的中间代谢产物[1]，化学性质极为活泼，氧化性强，体内蓄积会氧化蛋白质、脂质、核酸，导致细胞膜受损，引起心血管系统、免疫系统及神经系统疾病[2]，并加速衰老，直至死亡[3]。抗氧化剂可降低自由基的活性，通过有效清除自由基起到预防疾病的目的[4]。因此，从天然产物中开发安全、绿色的抗氧化组分，并将其应用于医疗、保健品、食品等，成为当前研究的热点[5]。查阅文献，目前常用的天然抗氧化剂主要来自包括黄酮、多酚和糖类等代谢产物[3]。

苜蓿（Medicago sativaL.）是豆科苜蓿属的通称，为多年生草本植物，是一种被世界各国公认的可持续发展的绿色能源。苜蓿具有蛋白质种类丰富、能适应各种不同的生长环境、产量高、再生快等优点[6-7]，是优良的豆科饲料，在很多国家作为牧草大量种植，有着“牧草之王”的美称[8]。苜蓿的地上部分富含多种有益于人类健康的营养成分，主要包括黄酮类、多糖、皂苷类、香豆素类、氨基酸以及其他活性成分[9-11]。研究表明，苜蓿具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、消炎、降血脂、增强免疫力等多种功效[12-13]，是极具发展前景的植物。但目前对苜蓿不同极性部位的黄酮类、酚类和多糖类含量的测定及抗氧化活性的研究很少报道。

我国的苜蓿资源虽然十分丰富，但目前主要是作为动物饲料，应用在农业与畜牧业方面，并未得到充分开发与利用，且市面上可以见到的苜蓿类功能食品也十分少[14]。如果把苜蓿应用于食品，不仅可以增加市面上的功能食品的类型，也将大大增加苜蓿的利用价值。此研究首次对苜蓿不同极性部位的活性成分及抗氧化活性进行分析，为以后进一步开发苜蓿资源，充分挖掘天然抗氧化产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苜蓿（2023年4月份采自甘肃省天水市秦州区），经河西学院张勇教授鉴定为豆科苜蓿属的紫花苜蓿。

芦丁标准品（博美生物科技，LC202007）；没食子酸标准品（上海源叶，C17D10C105997）；葡萄糖标准品（致远化学试剂，20211101810）；无水乙醇（利安隆博华医药化学公司，20230113）；石油醚（致远化学试剂，2019091062）；乙酸乙酯（致远化学试剂，2019091042）；正丁醇（致远化学试剂，2019092085）；福林酚（上海源叶，F15IS207169）；萘酚（上海麦克林生化科技，C14490323）；苯酚（成都科隆化学品，2021032301）；硝酸铝（成都科隆化学品，2021060403）；亚硝酸钠（天津百世化工，20200603）；镁粉（天津大茂化学试剂厂，20220701）；DPPH试剂（上海麦克林生物科技有限公司，C12998355）；ABTS试剂（上海麦克林生物科技有限公司，C12824507）；抗坏血酸（致远化学试剂，20220303）。

1.2 设备与仪器

UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；JC-QX-10L超声波清洗器（青岛聚创环保设备有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；PT-124/85S分析天平（福州华志科学仪器有限公司）；SY-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 研究方法

1.3.1 制备苜蓿醇提物不同极性部位

参考刘学贵等[15]紫花苜蓿提取物的方法。将200 g苜蓿粗粉，在70%乙醇、80 ℃、2 h、提取次数2次、料液比1∶10（g/mL）的提取条件下回流提取，将提取液进行合并、过滤，使用旋转蒸发仪将滤液减压浓缩至无醇味，将得到的溶液进一步浓缩。将浓缩到一定程度的溶液以1∶3混合于蒸馏水中，以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂，按极性由小到大的顺序等量萃取7次，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。

1.3.2 不同极性部位黄酮类、酚类、糖苷的鉴别

取石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位溶液各1 mL于试管中，备用。根据标准方法对植物粗提物进行植物化学评估，通过颜色的变化以确定是否存在黄酮类、多酚类和糖苷[3,16-18]。

1.3.2.1 黄酮类

在供试品溶液中加入适量镁粉，振摇之后加入几滴浓盐酸，1～2 min之后观察颜色变化。若含有黄酮类物质，溶液一般显红色到紫红色，个别显蓝或绿。

1.3.2.2 酚类

在供试品溶液中加入少量FeCl3溶液，若有蓝紫或紫红色出现，表明该溶液中有酚类物质的存在。

1.3.2.3 糖苷

在供试品溶液中加入0.2 mL的乙醇-萘酚（20%）溶液，混匀，沿试管壁缓缓加入2 mL浓硫酸，试管中的溶液分成2层，在两层的交界处出现紫红色环，则说明有糖苷的存在[19]。

1.3.3 芦丁标准曲线的制备

参考江春阳等[20]绘制芦丁标准曲线的方法，精确称取10.89 mg的芦丁标准品，置于25 mL的容量瓶中，以60%乙醇溶于其中，定容至刻度，分别取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9和1.0 mL芦丁标准品的溶液，放入10 mL容量瓶中，各加入0.9 mL亚硝酸钠溶液（5%），振摇使其混合均匀，放置3 min，再加入0.6 mL硝酸铝溶液（10%），振摇使其混合均匀，4 min后加入4.8 mL氢氧化钠溶液（4%），用60%的乙醇定容至刻度线，混匀，放置11 min。用蒸馏水作为空白对照，在波长510 nm处测吸光度，平行3次，取平均值。以吸光度为纵坐标，芦丁对照品溶液的浓度为横坐标，制作标准曲线，得到回归方程：Y=0.012 3X+0.001 1，R2=0.999 4，浓度和吸光度线性关系良好，可用于黄酮含量的测定。

1.3.4 没食子酸标准曲线的制备

参考谭晓舒等[21]绘制没食子酸标准曲线的方法。精确称取12.18 mg没食子酸标准品置于10 mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容到刻度，精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mL放入不同的棕色容量瓶中，将溶液稀释并定容至刻度，再分别精密量取0.7 mL不同浓度的没食子酸对照品溶液放入不同试管中，每个试管中加入2.5 mL 0.1 mol/L的福林酚溶液，10 min后量取2.5 mL 7%的碳酸钠溶液加入各个试管中，将其放在暗处，避光反应1 h。用对应试剂作为空白对照，在波长765 nm处测吸光度，平行3次，取平均值。将吸光度作为纵坐标，没食子酸对照品溶液浓度作为横坐标，绘出标准曲线，得到回归方程：Y=0.012 5X-0.002 7，R2=0.999 4，浓度和吸光度线性关系良好，可用于多酚含量的测定。

1.3.5 葡萄糖标准曲线的制备

参考李萧娜等[22]绘制葡萄糖标准曲线的方法。精确称取10.66 mg葡萄糖标准品，置于100 mL容量瓶内，用蒸馏水定容至刻度，精密量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6 mL的葡萄糖标准品溶液于试管中，补加蒸馏水至2 mL各试管中再分别加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，室温下放置10 min，沸水浴20 min，冷却至室温。用对应的试剂作空白对照，于490 nm波长处测吸光度，平行3次，取平均值。以吸光度作为纵坐标，葡萄糖对照品溶液浓度作为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.060 8X-0.004 5，R2=0.999 6，浓度和吸光度线性关系良好，可用于糖含量的测定。

1.3.6 不同极性部位成分的含量测定

根据对各极性部位成分鉴别的结果，使用可见分光光度法测定不同极性部位所含黄酮、酚酸和糖的浓度，并按式（1）计算苜蓿各成分质量（%）。

式中：C为根据标准曲线计算得到的质量浓度，μg/mL；D为稀释倍数；V为萃取液体积，mL；M为苜蓿质量，g。

1.3.7 抗氧化活性检测

将2.1小节中得到的不同极性部位的提取物溶液浓缩成浸膏。将各极性部位的浸膏配制成质量浓度为5 mg/mL的溶液，精密量取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL配制好的提取物溶液，置于5 mL的容量瓶中，将其稀释定容至刻度，备用。配制5 mg/mL的维生素C溶液，作为阳性对照组。精密量取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL维生素C对照品溶液，放入5 mL的容量瓶中，定容至刻度线，备用。

1.3.7.1 ABTS自由基清除能力测定

ABTS工作液：准确量取5.0 mL 7.0 mmoL/L的ABTS溶液，5.0 mL 2.45 mmoL/L的过硫酸钾水溶液，将其混匀，在室温下，放置在黑暗处反应12～16 h后，用无水乙醇进稀释，当它在波长734 nm处测定的吸光度为0.70±0.03时，停止稀释，该溶液可以进行抗氧化活性试验。

参考刘敏卓等[23]的体外抗氧化活性分析方法。取0.1 mL的不同浓度的不同极性部位溶液与不同浓度的维生素C对照品溶液，分别加入0.9 mL的ABTS工作液，振摇，混均，于30 ℃水浴5 min。在波长734 nm处测定吸光度。平行3次，求平均值。ABTS自由基清除率按式（2）计算。

式中：A0为0.1 mL无水乙醇溶液+0.9 mL ABTS工作液的吸光度；A1为0.1 mL供试品溶液+0.9 mL ABTS工作液的吸光度。

淮河流域多年平均降水量的地区分布很不均匀，大致从流域东南部向西北部递减，而地表径流的分布受地形的影响，在地域上变化幅度较大。因为水资源的禀赋与旱灾的形成具有密切的关系，因此，在进行干旱分区时应将该因素纳入考虑范畴。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力测定

参考陈建双等[24]的方法。量取0.2 mL的不同浓度的不同极性部位溶液、不同浓度的维生素C对照品溶液，在各个溶液中分别加入0.2 mL DPPH溶液，振摇使其混合均匀，在室温下暗处放置30 min。在517 nm波长处测定吸光度，平行3次，取平均值。DPPH自由基清除率按式（3）计算。

式中：A0为无水乙醇和DPPH各0.2 mL混匀后溶液的吸光度；A1为供试品溶液和DPPH溶液各0.2 mL混匀后溶液的吸光度。

1.3.7.3 羟自由基清除能力测定

参考陈建双等[24]的方法。分别取1.0 mL H2O2（8.8 mmol/L）、FeSO4（10.0 mmol/L）和水杨酸（10.0 mmol/L，溶于无水乙醇），放入37±2 ℃水浴中，加入1.0 mL待测样品，再加入1.0 mL H2O2用以启动反应，计时30 min，反应结束后，迅速将反应液放置于波长510 nm处测定吸光度，并以蒸馏水代替样品作空白对照。羟自由基清除率按式（4）计算。

式中：A1为供试品溶液+试剂的吸光度；A0为蒸馏水+试剂的吸光度。

1.3.7.4 铁离子还原能力测定

参考徐晨晨等[25]的测定方法。取不同浓度的不同极性部位溶液与不同浓度的维生素C对照品溶液各1.0 mL，加入1%的铁氰化钾、PBS缓冲液（pH 6.6）各1 mL，在50 ℃的水浴中静置20 min，快速冷却后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，混匀后按3 000 r/min离心10 min，取1 mL的上清液，加入等体积的蒸馏水和0.05%三氯化铁，混匀，在波长700 nm处测吸光度，平行3次，取平均值。一定程度上吸光度与还原能力呈正比。总还原能力（A）按式（5）计算。

式中：A1为加入样品后的吸光度；A0为溶剂本身的吸光度。吸光度越大，表明该样品还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 不同极性部位黄酮类、酚类、糖苷的鉴别结果

盐酸-镁粉是最常见的鉴别黄酮的反应之一，大部分黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物在盐酸-镁粉体系中会显橙红到紫红色，还有少数显紫～蓝色，而且当B环上存在—OH取代时，颜色变化会更加明显。试验结果显示，石油醚部位显示出绿色，在乙酸乙酯部位显示出红色，表明黄酮主要分布在石油醚部位和乙酸乙酯部位。

大多数具有羟基和SP2杂化的碳原子结构的化合物（碳碳双键上的碳原子）都能与三氯化铁溶液发生显色反应。酚羟基直接连在芳环上，相当于烯醇结构，所以也可以与三氯化铁溶液发生显色反应。试验结果显示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位出现了明显的紫红色，表明酚类主要分布于乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

硫酸-萘酚反应可以识别提取物中的糖，在浓硫酸或浓盐酸的作用下，糖类脱水形成糠醛及其衍生物，后者与α-萘酚反应生成紫红色络合物，在含有糖的溶液和浓硫酸溶液的液面交界处形成紫红色环。Molisch反应是鉴别糖的最常见的反应。试验结果显示，在水部位与石油醚部位出现了紫红色环，表明糖主要分布在水部位与石油醚部位部位。

2.2 不同极性部位成分的含量测定

不同极性部位黄酮、酚酸和糖的含量测定结果如表1所示。

表1 不同极性部位黄酮、酚酸和糖的含量

由芦丁标准曲线可得，黄酮在乙酸乙酯部位浓度最高为0.144 6 mg/mL，水部位浓度最低为0.067 1 mg/mL，由公式（1）可知，黄酮在乙酸乙酯部位含量为0.100 4%，在水部位含量为0.077 3%。

由没食子酸标准曲线可得，酚类在乙酸乙酯部位和正丁醇部位的浓度为2.697 5和2.574 9 mg/mL，由公式（1）可知，多酚在乙酸乙酯部位和正丁醇部位的含量为3.117 5%和2.975 1%。

由葡萄糖标准曲线可得，糖类在水部位的浓度为1.154 2 mg/mL，在石油醚部位浓度为1.069 9 mg/mL。由公式（1）可知，糖类在水部位含量为1.334 4%，在石油醚部位的含量为1.236 2%。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 ABTS自由基清除率

ABTS+是被用来测定纯度较高的物质或水溶液的总抗氧化能力的基础。ABTS会被一些氧化剂氧化，如MnO2或H2O2等试剂，生成呈现蓝绿色的自由基阳离子ABTS+。在一些可以提供电子的抗氧化剂（如酚类物质）存在的情况下，则生成没有颜色的ABTS[26]。采用过硫酸钾氧化法制备的ABTS+，这种自由基的强吸收出现在波长734 nm附近。苜蓿不同极性部位萃取液对ABTS自由基的清除率结果见图1。石油醚部位的清除能力最低，乙酸乙酯与正丁醇部位清除能力高于石油醚部位，都比对照品维生素C的清除率低，随着浓度的增大，乙酸乙酯部位与正丁醇部位的清除能力越来越接近。水相部位在浓度低于2.986 2 mg/mL时，清除能力低于对照品维生素C的清除能力，随着浓度逐渐增大，水部位的清除能力也逐渐升高，超过了对照品VitC的自由基清除能力，并在浓度大于2.986 2 mg/mL时，上升趋势逐渐趋于平缓。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位清除能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

图1 苜蓿醇提取物不同极性部位的ABTS清除率

2.3.2 DPPH自由基清除率

在乙醇溶液中，DPPH是一种相对稳定的自由基，在乙醇溶液中显紫红色，添加抗氧化剂之后，DPPH自由基溶液的颜色从紫红色变为黄色[27]。孤对电子的强吸收出现在波长517 nm附近，孤对电子与自由基清除剂配对以后，吸收将会减弱或消失。吸收减弱的多少可以反映出自由基清除剂活性的高低，DPPH清除率越高，说明抗氧化能力越强。

苜蓿不同极性部位萃取液对DPPH自由基的清除率结果见图2。石油醚组与乙酸乙酯组的清除能力基本无差异，正丁醇组清除率较强，但石油醚组，乙酸乙酯组，正丁醇组清除能力均低于对照品维生素C。水相部位在0.995 4 mg/mL的浓度时清除率低于对照品维生素C，1.990 8～3.981 6 mg/mL时高于对照品维生素C，4.997 mg/mL时清除率出现下降趋势。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位清除能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

图2 苜蓿醇提取物不同极性部位的DPPH清除率

2.3.3 羟自由基清除率

利用Fenton反应先产生羟自由基：H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+。若加入水杨酸，则羟自由基与水杨酸会反应生成2.3-二羟基苯甲酸，在510 nm波长处有吸收峰。如果向反应体系中加入能清除羟自由基的物质，则羟自由基的生成就会减少，从而使有色化合物的生成量相应减少[28]。采用固定反应时间法，在波长510 nm处测量含被测物反应液的吸光度，通过比较，判断被测物质清除羟自由基的能力。

苜蓿不同极性部位萃取液对羟基自由基清除率结果见图3。石油醚组清除能力最低，乙酸乙酯组与正丁醇组清除能力接近，正丁醇组在0.995 4～1.990 8 mg/mL时，清除率呈下降趋势，在1.990 8～4.977 mg/mL时为上升趋势，在1.990 8 mg/mL时清除率低于乙酸乙酯组，水相的清除能力最高。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位清除能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

图3 苜蓿醇提取物不同极性部位的羟自由基清除率

2.3.4 铁离子还原能力测定

铁氰化钾的Fe3+被样品的抗氧化作用还原成Fe2+（亚铁氰化钾），生成的Fe2+（亚铁氰化钾）进一步和Fecl3反应，生成普鲁士蓝，在波长700 nm处有最大吸光度，因此测定此处吸光度值可以间接反映抗氧化剂的还原能力大小[3,29]，二者大小呈正比。

苜蓿不同极性部位萃取液对铁离子还原能力结果见图4。石油醚组与乙酸乙酯组的清除能力相近，正丁醇组抗氧化能力强于石油醚组和乙酸乙酯组，石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组的铁离子还原能力随浓度的增大，上升的趋势比较缓慢。水相的铁离子还原能力随浓度的增大，上升的趋势较快。水相、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、石油醚部位还原能力相比：水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。

图4 苜蓿醇提取物不同极性部位的总还原能力

3 讨论与结论

此研究采用了液-液萃取法，将苜蓿醇提物分为石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。采用盐酸-镁粉法、三氯化铁试剂和硫酸-萘酚反应鉴别提取物中的黄酮类、酚类和糖。此研究结果表明，紫花苜蓿提取物各极性部位黄酮、多酚和糖类化合物的分布各不相同，其中乙酸乙酯部位含有黄酮和多酚类化合物最多，水部位含有糖类物质最多。

通过测定苜蓿的不同极性部位对DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基清除能力和总还原能力，结果表明紫花苜蓿不同极性部位均具有抗氧化能力，且在所测范围内有计量相关性，其抗氧化能力强弱顺序为水＞正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚，由此可见，紫花苜蓿抗氧化的活性成分集中在水部位，而糖类主要分布在水相中，提示糖是紫花苜蓿抗氧化的主要成分，而酚羟基是构成多糖类化合物的主要基团之一，使其具备有效的抗氧化的能力[30]。另外，紫花苜蓿的抗氧化能力除了与活性物质的含量有关，也可能受到其他因素的影响。本试验通过萃取实现了紫花苜蓿醇提物中抗氧化成分的富集。

以上结果表明，紫花苜蓿各极性部位中活性成分差异较大，各部位抗氧化程度不同。此研究为苜蓿资源的进一步开发研究提供了理论支持，对天然抗氧化剂的开发提供更充分的理论依据。