分光光度法测定湖泊水中叶绿素a含量的研究

赵荣龙 梁欣欣 吴玉萍 崔丹 张玲

摘 要：叶绿素a含量是评价水体富营养化水平的重要依据，水体营养化程度过高会影响水生生物的生存和繁殖，导致水体生态系统紊乱，生物多样性受到破坏。叶绿素a几乎是所有浮游植物类别都含有的叶绿素类型。所以，叶绿素a含量既是水体富营养化的判断标准，又是浮游植物现存量的重要推断依据。水体富营養化是我国当前水环境面临的主要问题。为阐明分光光度法测定水体中叶绿素a含量结果的快速性和准确性，本研究用研磨机代替手工研磨进行样品制备，用标准物质进行加标测定。结果显示叶绿素a检测值符合标准要求。

关键词：分光光度法，水体，叶绿素a

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.07.041

0 引 言

叶绿素a的含量是评价水体富营养化水平的重要依据，通过叶绿素a的含量可以估算出水体中浮游植物生物量[1-2]。浮游植物存量过高会造成水体的透明度降低，阳光难以穿透水面阻碍水体中植物进行光合作用，植物本身的呼吸作用会导致水体中氧气被消耗，所以造成水体局部缺氧，而水体表面的浮游植物通过光合作用又会释放大量氧气，这样会形成水体中缺氧，水面氧气过饱和的情况，水生动物（如鱼类）会因为缺氧而死亡；浮游植物生物量过高还会造成底层浮游生物堆积，在厌氧条件下分解发酵产生有害气体和毒素，伤害水生生物[3]；营养化程度高的水体中含有大量的硝酸盐和亚硝酸盐，高含量硝酸盐和亚硝酸盐水体对人类和其他动物饮用水安全有很大危害。所以，如何快速、准确地检测水体中叶绿素a含量并对水体中叶绿素a含量进行合理控制，这对保护水资源、改善水环境尤为重要。

1 实验部分

1.1 主要仪器和材料

玻璃纤维滤膜（孔径：0.45 μm）。

离心管（PTFE材质15 mL）。

研磨珠（材质：氧化锆；规格：5 mm）。

Tiss-24多样品组织研磨机（上海净信实业发展有限公司）。

DT5-1低速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）。

D R 2 8 0 0 便携式可见分光光度计（美国哈希）。

针式滤器（直径：25 mm；孔径：0.45 μm）。

比色皿（1 cm）。

1.2 试剂

丙酮：GR（西陇科学）。

丙酮溶液（配比9+1：9 0 0 m L丙酮+10 0 m L纯水）。

叶绿素a溶液标准物质（含量：10 0±3% μg /mL；产品编号：BW91697-01，北京普析标准技术有限公司）。

叶绿素a标准中间液：ρ（叶绿素a）=1.00 μg/mL。

移取1.00 mL叶绿素a标准贮备液于100 mL容量瓶中，用丙酮稀释至标线，混匀。

1.3 样品

1.3.1 样品的采集

采集分析叶绿素a样品的水样可以使用500 mL的玻璃瓶作为采样瓶，在距离水面0.5 m的地方进行水样采集，如果水深不足0.5 m时采集距离水面中部的水样。如果有泥沙和其他杂物时应将水样静止30min后取水面下5 ㎝的水样作为分析样品。水样采集完毕宜尽快送实验室。

1.3.2 样品的制备

用量筒准确量取水样100 mL，将水样倒入事先准备好带滤膜的过滤装置上进行抽滤，注意抽滤时负压不要过大以免抽破滤膜。待抽滤快结束时用水清洗抽滤器内壁，抽滤结束后取出滤膜，撕去多余空白滤膜然后将有抽滤物的部分对折放入离心管中。在每个离心管中加入一颗研磨珠，将抽滤物和研磨珠压至离心管底部，用分液器在每支离心管中定量加入丙酮溶液10 mL盖上盖子，将离心管移至多样品组织研磨机上充分研磨5 min。取出离心管移至离心机以转速3000 r/min的速度离心10 min，取出离心管用纸包好放入0～4℃的冰箱中避光浸泡提取2 h。以实验室用水代替样品做空白实验。

1.4 分析

打开分光光度计电源并预热15 min，以丙酮溶液进行仪器调零。用针式滤器将浸泡提取好的样品过滤至比色皿中在波长750 nm、664 nm、647 nm、630 nm处测量并记录吸光度。波长750 nm处吸光度测量值应小于0.005，测定值不满足要求时需检查比色皿中样品是否存在气泡，如有必要进行二次过滤后测定。

结果计算[4]，按照实验流程首先计算出定容后提取液中叶绿素a的质量浓度为：

然后再计算出水样中叶绿素a的质量浓度为：

式中：

ρ1——水样的叶绿素a质量浓度，μg/L；

ρ2——提取液的叶绿素a质量浓度，mg/L；

A 664——提取液在664 nm波长测定的吸光度；

A 647——提取液在647 nm波长测定的吸光度；

A 630——提取液在630 nm波长测定的吸光度；

A 750——提取液在750 nm波长测定的吸光度；

V1——提取液定容体积，mL；

δ——比色皿光程，cm；

V——水样体积，L。

2 结果与讨论

2.1 分析结果

2.1.1 准确度

为验证本方法的准确度对滇池某采样点（叶绿素a含量：79 ug/L）的水样进行6次加标平行检测，在每个样品中加入1.00 ug/mL的叶绿素a标准物质0.50 mL。计算该样品的加标回收率，结果显示加标回收率为78.00%～106.0%，见表1。

2.1.2 精密度

为验证本方法的精密度分别对滇池某采样点A（叶绿素a含量：27 ug/L）和样点B（叶绿素a含量：46 ug/L）的水样各进行10次平行检测，计算该样品分析结果的相对标准偏差（RSD），结果显示相对标准偏差在1.0%～6.0%之间，见表2。

2.2 方法注意事项

（1）丙酮溶液的配制要严格按照90 mL丙酮+10 mL纯水的比例进行配制，否则在测试过程中可能会造成吸收峰的漂移，影响检测结果的准确性。

（2）叶绿素a见光易分解，实验过程中浸泡提取要注意避光操作。

（3）抽滤的过程中要避免因为抽滤压力过大而造成叶绿素a的损失，因为过大的抽滤压力会造成样品细胞被破坏或穿透滤膜。

（4）为保证浮游植物能够被充分研磨，研磨时间至少应保证5 min以上，研磨充分的样品比较容易提取和分离。

3 结 语

提高工作效率，降低工作负荷和劳动强度，保护工作人员身心健康是现代企业管理的重要组成部分。用研磨机代替手工研磨进行样品制备，不但能够有效地降低分析人员的劳动强度，还能减少工作人员在研磨过程中造成叶绿素a的损失，提高分析准确度。丙酮对人体的伤害极大，人工操作过程中丙酮易挥发，对研磨过程进行密闭处理是不现实的。所以不论从分析结果的准确性、人工操作的安全性还是从人机功效方面的考虑，采用机器研磨的方式代替手工研磨都势在必行。

参考文献

[1]黄晓丽，罗娅敏，赵志友，等.叶绿素a分光光度法的研究[J].科学技术创新，2021（24）：41-42

[2]张婧.水中叶绿素a测定方法的比较研究[J].科技创新与应用，2022，12（19）：130-134

[3]邹敏，蹇川，李文俊.叶绿素a分光光度法测定探讨[J].皮革制作与环保科技，2021，2（2）：18-20.

[4]生态环境部.水质 叶绿素a的测定 分光光度法：HJ 897—2017[S].

作者简介

赵荣龙，本科，工程师，研究方向为环境分析与保护。

（责任编辑：张瑞洋）