胃癌前病变病证结合动物模型研究进展*

王颖 矫健鹏 徐晶钰 刘煊 王晓炜 岳小强**

(1.山东中医药大学,山东 济南 250355;2.海军军医大学附属长征医院,上海 200003)

胃癌(Grastic Cancer,GC)是全球第三大癌症,更是我国最常见的恶性肿瘤之一[1]。根据国家癌症中心的数据,2020年我国癌症新发病例数中胃癌48万、死亡人数37万,分别位于第三位和第二位。胃癌前病变(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)是指一类容易发生癌变的胃黏膜病理组织学变化,主要包括胃黏膜上皮异型增生和肠上皮化生两种类型,多伴存于慢性萎缩性胃炎中。PLGC是胃癌发生前的一个重要阶段,加强对其相关研究,积极进行早诊早治,对于降低我国胃癌发病率、改善患者预后至关重要。近年来,中医药在参与胃癌前病变防治中的作用和地位越来越受到重视[2]。辨证论治是中医药的特色与优势,病证结合动物模型则是在中医药理论、现代医学理论和实验动物科学等知识的相结合下,在动物身上模拟出与疾病和证候相类似的特征[3],非常适合进行中医药相关的胃癌前病变研究。本文就胃癌前病变研究中病证结合动物模型的制备方法做一总结。

1 模型动物的选择

因为PLGC造模时间较长,大鼠为最常用的实验研究对象,品系主要为Wistar和SD大鼠,多选择雄性或雌雄各半。近年来,基因敲除小鼠也被引入到PLGC动物模型中,如胃泌素敲除小鼠(GAS-/)、IL-1β转基因小鼠(C57 BL/6品系)、K-ras转基因小鼠、Tff 1基因敲除小鼠(Tff 1-/)、p53基因敲除小鼠、Klf4基因敲除小鼠都以C57 BL/6品系小鼠为主,胰岛素胃泌素转基因小鼠(INS-GAS,FVB/N品系)、Apt4a基因敲除小鼠(H+/K+-ATP酶缺失,C57)等[4-5]。基因敲除动物模型虽然成模效果显著,但对于模型小鼠要求较高,且制作成本高,目前实际应用仍较少。

2 PLGC疾病模型

疾病造模是病证结合动物模型的基础。目前学者针对PLGC多以复合因素造模,通过化学诱变剂甲基硝酸亚硝酸胍(1N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)自由饮用或灌胃诱发黏膜病变,配合饥饱失常、乙醇(白酒)灌胃、泻下药物、高热食物(60℃热面糊)、情绪刺激(夹尾)、劳累刺激等方式,来模拟人PLGC的发生机制。MNNG是一种N-亚硝基化合物,作用机制为分解成短寿命、高反应的亲电试剂,最终的诱变剂被认为是碱离子。Sugimura等于1967年首次发现将饮用水混合MNNG溶液喂养大鼠会诱发胃腺癌[6]。大鼠前胃对MNNG有很高的亲和力,MNNG直接作用于胃黏膜而引起癌变,致癌机制为损伤细胞DNA,故常应用于胃癌及癌前病变中[7]。MNNG的给药方式分为自由饮用和灌胃,并且实验结果与浓度相关,其中自由饮用的浓度为60～180 μg·mL-1,灌胃的浓度为80～250 μg·mL-1,造模时间大约在20～24周不等[8-9]。

3 病证结合动物模型

目前中医学者根据胃癌前病变患者的典型表现,认为其临床证候主要有脾胃虚弱、胃阴不足、肝胃气滞、脾胃湿热和胃络瘀血证五大类型[10]。

3.1脾胃虚弱病证结合模型 “脾胃虚弱”为CAG及其癌前病变的发病之本[11],也是其核心病机与证候。郑嘉怡等[12]采用200 μg·mL-1MNNG自由饮用配合饥饱失常法(隔日禁食)复制PLGC脾虚证大鼠模型,在研究过程中发现,造模18周后雄性SD大鼠出现食欲不振、精神萎靡、便溏等症状,与临床PLGC脾虚证表现相似。病理显示肠上皮化生、异型增生,黏膜下血管密布,出现扩张微血管,甚至一只大鼠出现原位癌病变。朱萱萱等[13]通过每周两次采用170 μg·mL-1的MNNG溶液和40%乙醇对大鼠进行灌胃,并给予150 μg·mL-1的MNNG溶液自由饮用,造模10周,采用破气苦降(耗气泻下药)、第五周饥饱失常(单日禁食、双日饱食)和大鼠疲劳仪(大鼠每天跑步30 min)建立CAG脾气虚模型。10周后SD大鼠体重和体温明显降低,摄食量和饮水量降低不明显,提示脾虚证成模,而在第4周就会开始出现肠化生、不典型增生等PLGC病理。张宏等[14]使用过食酸味而致脾虚的方法进行造模[15],饥饿48 h后灌胃山西白醋(首次每日15 mL·kg-1,以后每日10 mL·kg-1),10 日后以酸度3.5 g·100 mL-1的2-乙基亚硝胺(每日2.8 mg·kg-1)灌胃,每日1次,连续灌胃4个月,120天后NIH小鼠出现体重减轻、食欲减退,活动量减少,大便溏泄或成小干颗粒状等表现。

3.2胃阴不足病证结合模型 李明等[16]和张杨等[17]都以100 μg·mL-1MNNG溶液灌胃,配合35%的无水乙醇每周一、四灌胃,60℃热面糊每周二、五灌胃,含0.3 g·kg-1雷尼替丁饲料喂养来构建PLGC胃阴不足证候模型。16周后模型组多数Wistar大鼠出现精神状态欠佳,行动迟缓,被毛疏松暗淡,食欲较差、形体偏瘦,大便时有不成形等胃阴不足的症状,肉眼观察到胃壁弹性较差,颜色偏白,病理检测出现肠化生。沈琪等[18]予100 μg·mL-1MNNG溶液自由饮用,以含0.03%雷尼替丁饲料喂养,加以饥饱失常法(饮食2天,禁食1天)、禁食下午灌胃40%乙醇10 mL·kg-1、下午灌胃0.017 浓度MNNG溶液1 mL·kg-1造模,12周后模型组SD大鼠出现了精神萎靡、形态偏瘦、行动迟缓、嗳气等表现,病理显示胃黏膜较薄,光泽度不够,弹性较差,病理显示出现不同程度的异型增生,成功地建立了PLGC胃阴不足证大鼠模型。

3.3肝胃气滞病证结合模型 PLGC发病与情绪明显相关,肝胃气滞证动物模型的建立多通过夹尾刺激或慢性束缚来进行证候造模。胡运莲[19]予Wistar雄性大鼠自由饮用100 μg·mL-1MNNG,以含0.03%雷尼替丁的饲料喂养,采用饥饱失常法,进食2天,禁食1天。以10 mL·kg-1为计量标准,灌胃56℃15%盐水,进食下午灌胃20 mmol(0.85%)脱氧胆酸钠溶液,禁食下午灌胃40%的酒精。每周用钳子夹大鼠尾部30分钟,使之保持愤怒状态。连续造模24周,发现模型组大鼠体型偏瘦,食欲减退,大便质稀。病理上出现2例增生结节,组织学检查分别为早期腺癌和增生性息肉,提示肝胃气滞成模。

3.4脾胃湿热病证结合模型 近年来,由于生活水平的提高和饮食习惯的改变,人们嗜食肥甘厚味,湿热交阻而导致脾胃湿热证胃癌前病变患者日益增多。脾胃湿热证动物模型的建立多模拟湿热环境或高脂高糖饮食来造模,以大鼠出现大便时溏时结、臭秽,且有生化指标改变来提示造模成功。黄琴等[20]通过15日的“湿热环境加高脂高糖饮食和白酒综合法”来复制脾胃湿热证模型,再进行12周的灌服150 g·L-1浓度的55 ℃ 热盐水10 mL·kg-1,2%水杨酸(10 mL·kg-1,日1次)、饮用20 mmol·L-1脱氧胆酸钠,加以饥饱失常综合法(进食2日,禁食1日)来复制胃癌前病变模型。结果显示,12周后SD大鼠喜静,食欲下降,反应缓慢,大便时干时稀、臭秽难闻,胃黏膜腺体出现大部分萎缩消失的状况,可见肠上皮化生,提示造模成功。

3.5胃络瘀血证病证结合模型 中医认为“久病必有瘀”,PLGC多由CAG发展而来,病程时间较长,久病易使气血运行不畅,出现瘀血证候。旲佳慧[21]以150 μg·mL-1MNNG溶液予SD大鼠自由饮用,15%浓盐水灌胃(禁食日、2 mL·只-1),配合饥饱失常(2天进食1天禁食)和0.03%雷尼替丁饲料喂养,建立PLGC大鼠模型。24周后,模型组大鼠精神较差,粪便不成形,胃黏膜充血水肿,甚至黏膜下血管分布,与中医血瘀证候相似,且大量炎性细胞被浸润,可见不典型增生细胞,提示造模成功。刘庆生等[22]]以167 μg·mL-1MNNG溶液自由饮用,以0.017 mol·L-1浓度的MNNG溶液灌胃,1 mL·只-1,复制PLGC大鼠模型,12周后模型组SD大鼠皮毛暗淡,易受刺激,胃黏膜色暗发灰、少泽,部分出现出血糜烂点,与中医血瘀证候中出血症状相似。封慧等[23]采用以10 mL·kg-1的大鼠体重为计量标准,每周灌胃1次含0.03%雷尼替丁的MNNG溶液170 mg·L-1、每周2次400 mL·L-1乙醇,通过用这种综合造模法建立PLGC模型,造模12周后模型组SD大鼠体重明显减轻,增长速度缓慢,胃黏膜明显变薄,颜色偏白灰色,有散在出血点,部分水肿糜烂,舌质出现紫暗,并发血瘀证候。

4 病证结合动物模型的评价

在PLGC的动物模型中,以胃黏膜出现萎缩并伴有肠上皮化生或异型增生为主要的疾病成模标准。脾胃虚弱证的成模标准为:大鼠食欲不振,大便溏,喜静,苔薄白;胃黏膜苍白或灰白,黏膜变薄,黏液量多稀薄,胃蠕动变弱。胃阴不足证的成模标准为:大鼠形体消瘦,大便干结,舌红少苔;胃黏膜表面不平变薄,黏液减少,皱襞变细或消失,呈龟裂样改变。肝胃气滞证的成模标准为:大鼠表现为易激惹;胃黏膜呈急性活动性炎性反应,胃蠕动较快。脾胃湿热证的成模标准为:大鼠大便黏腻或稀滞,舌红苔黄腻;胃黏膜糜烂、充血红肿,黏液浑浊黏稠。胃络瘀血证的成模标准为:大鼠表现为舌暗红,有瘀斑、瘀点;胃黏膜存在出血点,血管呈暗红色[24]。

5 问题与展望

在病证结合动物模型中,疾病造模多以MNNG水溶液予动物自由饮用或灌胃为主,证候造模则在中医理论指导下进行。MNNG因其造模操作相对简便、成模率较高,因而在目前多数胃癌前病变研究中被广泛应用;其虽然作为常用的PLGC造模试剂,但目前文献中对于造模周期、死亡率的研究较少,使得MNNG造模技术运用中仍存在很多悬而未决的实际问题;而且,MNNG的发病机制与人类发病机制存在较明显的差别,使得其用于对PLGC疾病分子机制探讨上可能还存在一定问题[25-29]。

在中医证候造模中,虽然病证结合动物模型的研究取得了一定的进展,但在模型判定上大致符合人体证候表现,而人体与动物发病机制存在显著差异,故此类造模方法未得到众多研究人员认同;并且不同病证结合的造模方法不尽相同,未明确统一标准。中医证候动物模型的诊断依据应包括症状(本证)、病因(正证)、治疗(反证)、相关因素(佐证)、客观指标(佐证)五个方面[30],但目前多数证候动物模型尚不能满足以上全部五个标准。另外,病证结合动物模型由于干预措施复杂、步骤较多,客观上导致造模的可重复性较差。

总之,PLGC的发病周期长、机制复杂,其病证结合动物模型的研究虽然取得了一定进展,但还存在诸多实际问题,需要广大科研工作者在不断的实践中,不断发现并加以改进。