紫花牡荆素对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞损伤和NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE通路的影响

卢丽君 田辉 郑洋 胡汉姣 （武汉市中医医院肺系病科，武汉 430014）

常见的慢性气道炎症性疾病主要包括慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和哮喘，发病率、病死率和致残率均较高，给社会造成了巨大的经济负担［1-2］。COPD多发于40岁以上人群（发病率约为10%）［3］。哮喘是世界第二大致残致死疾病，专家预测2025年我国哮喘患者将达到4亿［4］。慢性气道炎症性疾病的病因复杂，多种细胞因子、炎症细胞如白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素等相互作用影响参与COPD和哮喘的发生和发展，促进气道炎症反应和气道损伤［5-7］。随着支气管扩张剂、抗氧化剂、磷酸二酯酶抑制剂和糖皮质激素等药物的使用，病死率和住院率略有下降，但往往会产生许多副作用，且对肺功能的衰退没有效果，因此继续寻找更加安全有效的药物具有重要的意义［8-10］。NF-κB和Keap1-Nrf2/ARE信号通路参与调节机体的炎症反应和氧化应激。近来多项研究发现NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白在肺部疾病中具有重要的调节作用。异甘草素能够上调Nrf2和NF-κB的表达，抑制COPD小鼠肺部的炎症和氧化应激［11］；补肺健脾益肾方能够下调NF-κB的表达，降低COPD大鼠肺组织中炎症因子的含量［12］。综上，NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE信号通路在缓解COPD导致的氧化应激和炎症过程中有重要作用。紫花牡荆素（casticin，CAS）是中药蔓荆子的主要成分，许多研究显示，CAS具有抗炎和调节氧化应激的作用［13-14］。但CAS是否通过调节NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE信号通路，进而缓解COPD导致的炎症还未阐明。本研究以BEAS-2B细胞为研究对象，构建细胞炎症模型，探讨CAS缓解COPD诱导的炎症反应的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂 人正常肺上皮细胞BEAS-2B源于中国科学院上海细胞库。气管上皮细胞培养基（Lonza；货号：CC3170）；PBS、0.25%胰蛋白酶、十二烷基硫酸铵、TEMED、过硫酸铵、Tween-20、RIPA（强）组织细胞快速裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio；货号分别为：P1010、T1350、S8010、T8090、A1030-1、T8220-100、R0010、PC0020）；脂多糖（来源于大肠杆菌055：B5）、紫花牡荆素（阿拉丁；货号：L118716、V117963）；ML385（Selleck；货号：S8790）；人IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ ELISA试剂盒（Bioswamp；货号分别为：HM10206、HN10001、HM10205、HM10115）；兔抗NF-κB p65、Keap1、Nrf2、GAPDH、Lamin B1、羊抗兔蛋白二抗（Bioswamp；货号分别为：PAB37352、PAB30175、PAB30615、PAB36269、PAB43971、SAB43714）；兔抗p-NF-κB p65（Abcam；货号：ab76302）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD；货号：556547）；蛋白质（Marker）（Helix；货号：P12103）；PVDF转移膜、化学发光试剂（Millipore；货号为：IPVH00010、WBKLS0500）。

1.1.2 仪器 超净工作台（苏州智净；型号：SW-CJ-1D）；生物安全柜（Spantech；型号：BSC-1300IIB2）；CO2恒温培养箱、移液器（Thermo；型号分别为：311、F3）；倒置荧光显微镜（Lecia；型号：DMIL LED）；流式细胞仪（艾森；型号：NovoCyte）；电泳仪（Bio-Rad；型号：mini protean 3 cell）；酶标仪（雷勃；型号：MK3）；干式恒温器（杭州爽盛；型号：K30）；全自动化学发光分析仪（上海天能；型号：Tanon-5200）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代 将BEAS-2B人正常肺上皮细胞培养于BEGM Bullet Ki（t气管上皮细胞培养基套装）中在37 ℃、5%CO2条件培养，按1∶2比例传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞损伤模型的构建 将细胞分为对照组和模型组，对照组换正常培养基，模型组换含有1 μg/ml脂多糖的培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，收集细胞进行后续检测。

1.2.3 ELISA检测炎症因子浓度，筛选最佳作用浓度和时间 利用不同浓度（0.5、1、2、5、10 μmol/L）的CAS分别预处理1 h、2 h和4 h，然后脂多糖干预BEAS-2B细胞损伤24 h。按照ELISA试剂盒说明书检测各组细胞上清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ浓度，得出抑制炎症的最佳作用浓度A和时间B。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将对照组细胞分为6组：正常组、模型组、Casticin（A）组、ML385（20 μmol/L）组、Casticin（A）+ML385（20 μmol/L）组、地塞米松（0.2 mol/L）组。正常组正常培养细胞不做任何处理，模型组按照1.2.2的方法构建模型，其他组分别用对应浓度的药物预处理B小时，然后进行造模。收集各组细胞，取1×106个培养基重悬的细胞，400 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清；加入1 ml预冷PBS，轻轻吹打混匀细胞，400 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清；将细胞重悬于200 μl PBS；加入10 μl Annexin VFITC和 10 μl PI，轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min；加入300 μl PBS，随即进行流式细胞术检测，使用Novo-Express分析软件进行分析。

1.2.5 ELISA检测各组细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的浓度 按照ELISA试剂盒说明书检测各组细胞上清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量。

1.2.6 Western blot 检测CAS对细胞NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE通路的影响 将细胞取出后吸去培养液，适量预冷的PBS洗涤2次，吸去PBS，按照1×106个细胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液200 μl，4 ℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5 ml EP管中，在4 ℃、12 000 g离心10 min，取上清，进行蛋白质定量。将各组样品于12%SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭4 ℃过夜。分别加入兔抗NF-κB p65（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）、Lamin B1（1∶1 000）室温孵育1 h。洗膜3次，孵育山羊抗兔二抗（1∶10 000）室温1 h。洗膜3次后，将膜放置在暗室中，根据用量取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面与之充分接触。然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

1.3 统计学处理 使用SPSS25.0进行统计学分析，计量资料以±s表示，先进行正态性和方差齐性检验，若符合正态分布且方差齐性，则多组间比较使用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验，若不符合则进行秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选CAS的最佳作用浓度和时间 结果如图1所示，随着CAS浓度的升高，炎症因子的含量逐渐下降，CAS浓度为10 μmol/L时炎症因子的含量最低，因此选择10 μmol/L为CAS的最佳作用浓度；图中可以看出，当CAS的浓度为10 μmol/L时，随着处理时间的延长TNF-α的含量不断下降［4 h时含量为（143.14±5.23） pg/ml］，而IFN-γ［（100.60±0.78） pg/ml、IL-6（60.82±2.24） pg/ml、IL-1β（131.56±2.85） pg/ml］都是在处理2 h时的含量最低，因此最佳处理时间为2 h。

图1 不同浓度CAS对细胞炎症因子的影响Fig.1 Effects of different concentrations of CAS on inflammatory factors

2.2 CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞凋亡率的影响 结果见图2。与正常组相比，模型组的细胞凋亡率［（35.79±1.38）%］显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，Casticin组和地塞米松组细胞凋亡率［（20.43±0.19）%；（20.48±0.41）%］显著降低（均P＜0.01）；与ML385组相比，Casticin+ML385组的细胞凋亡率［（28.54±0.67）%］显著降低（均P＜0.01）。

图2 CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞凋亡率的影响Fig.2 Effect of CAS on apoptosis rate of BEAS-2B cells induced by lipopolysaccharide

2.3 CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞炎症反应的影响 与正常组相比，模型组IL-1β［（508.02±4.52） pg/ml］、TNF-α［（525.26±1.79） pg/ml］、IL-6［（244.65±1.36） pg/ml］、IFN-γ［（417.63±5.22） pg/ml］的含量均显著升高（均P＜0.01）；与模型组相比，Casticin组和地塞米松组IL-1β［（341.48±5.00） pg/ml；（242.52±4.39） pg/ml］、TNF-α［（342.27±4.71） pg/ml；（217.95±2.55） pg/ml］、IL-6［（141.41±1.88） pg/ml；（91.54±1.01） pg/ml］、IFN-γ［（259.32±5.74） pg/ml；（190.52±3.44） pg/ml］含量均显著降低（均P＜0.01）；与ML385组相比，Casticin+ML385组IL-1β［（256.22±6.11） pg/ml］、TNF-α［（188.76±1.81） pg/ml］、IL-6［（111.15±2.02） pg/ml］、IFN-γ［（229.07±1.50） pg/ml］的含量均显著降低（均P＜0.01）。见图3。

图3 CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞的炎症反应的影响Fig.3 Effect of CAS on inflammatory response of lipopolysaccharide- induced BEAS-2B cells

2.4 CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞NF-κBKeap1-Nrf2/ARE通路的影响 结果见图4。与正常组相比，模型组p-NF-κB p65（0.50±0.01）和Keap1（0.58±0.01）蛋白水平显著升高（P＜0.01），细胞和细胞核中Nrf2（0.32±0.01；0.41±0.02）蛋白水平显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，Casticin组p-NFκB p65（0.36±0.02）和Keap1（0.42±0.02）蛋白水平显著降低（P＜0.01），细胞和细胞核中Nrf2（0.48±0.02；0.59±0.04）蛋白水平显著升高（P＜0.01）；与ML385组相比，Casticin+ML385组p-NF-κB p65（0.41±0.02）和Keap1（0.47±0.02）蛋白水平显著降低（P＜0.01），细胞和细胞核中Nrf2（0.41±0.02；0.54±0.01）蛋白水平显著升高（P＜0.01）。

图4 CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞NF-κB-Keap1-Nrf2/ARE 通路的影响Fig.4 Effects of CAS on NF-κB-KEAP1-NRF2/ARE pathway in lipopolysaccharide-induced BEAS-2B cells

3 讨论

慢性气道炎症性疾病的病死率较高，仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康安全［15］。炎症机制是引起COPD和哮喘等慢性气道炎症性疾病的主要机制［16-17］。炎症反应介导的炎症可影响肺实质和气道，引起肺组织结构的变化，并使气道变得狭窄。炎症细胞如淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等参与气道的慢性炎症过程，释放大量的炎症因子，这些炎症因子可以调节炎症细胞的功能，从而影响气道炎症反应［18］。研究表明，CAS的药理作用主要有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗催乳素等，可以抑制炎症因子的释放从而发挥抗炎的作用［19］。诸多研究表明CAS在治疗肺疾病方面有着一定的作用。WANG等［20］发现CAS能抑制脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤，LEE等［21］也发现CAS能改善吸烟导致的小鼠急性肺炎症状，但其机制尚不明确。因此，本研究以BEAS-2B细胞为研究对象，利用脂多糖构建细胞炎症模型，探究CAS治疗慢性气道炎症性疾病的可能机制。

细胞凋亡是一种非常严格的程序性细胞死亡，能够去除机体不需要的细胞或者异常细胞，有重要的生物学意义。研究发现细胞凋亡在COPD等的发病过程中具有重要的作用［22］。本研究发现CAS可以降低细胞凋亡率，提示CAS具有抑制细胞凋亡的作用。为进一步验证CAS对炎症反应的影响，本研究检测了CAS对脂多糖诱导的BEAS-2B细胞炎症反应的影响，结果显示CAS能够降低炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ的含量，表明CAS能够缓解气道炎症反应。

NF-κB在细胞的炎症反应和免疫应答等过程中具有重要的作用。研究发现党参多糖能够下调NFκB mRNA表达，减轻COPD大鼠气道炎症反应［23］。核转录相关因子-2（Nrf2）广泛存在于多个器官和组织，在肺泡巨噬细胞和肺部上皮细胞中高表达。Nrf2信号通路核心分子包括Nrf2、Kelch样ECH相关蛋白-1（Keap1）和抗氧化反应元件（ARE）。Keap1-Nrf2-ARE信号通路是机体抗氧化应激的主要机制，在正常生理状态下，Nrf2被Keap1隔离在细胞质中，一旦发生氧化应激，Keap1就会释放Nrf2，使其进入细胞核与ARE结合，发挥抗氧化和抗炎的作用［24］。近年来发现多种中医药提取物和方剂能够通过调控Nrf2信号通路达到缓解COPD过程中炎症或者氧化应激的目的［25-27］。研究表明，Keap1不仅能调节Nrf2，还能调节NF-κB信号通路，两条通路间具有相互作用［28］。本研究也同样发现CAS能够缓解气道炎症反应，其机制与NF-κB-Keap1-Nrf2-ARE信号通路有关。为了进一步验证此结果，又利用ML385（Nrf2抑制剂）处理细胞，结果显示CAS仍能缓解抑制Nrf2所引起损伤，降低细胞凋亡率和炎症因子的含量，这表明CAS是通过调节Nrf2信号通路来发挥缓解气道炎症反应的作用。

综上所述，CAS可减轻气道炎症反应，其机制与CAS调控NF-κB-Keap1-Nrf2-ARE信号通路有关。