非生物型人工肝技术的优化与生物型人工肝研究进展

周 莉， 杨颜榕， 陈 煜

首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心四科（疑难肝病及人工肝中心）， 肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室， 北京 100069

肝衰竭是一种临床常见的综合征，以多种因素引起严重的肝功能损伤为特征，以黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水为主要临床表现，病死率极高［1］，肝移植是其唯一的治愈方法。中国肝移植注册中心数据表明，2018—2020 年我国平均每年肝移植约6 000 例［2］。目前尚无官方统计数据显示肝衰竭的患病人数，据估计，临床上每年肝衰竭患者实施肝移植的比例低于2%［3］。肝源紧缺、肝移植费用昂贵等原因使肝移植并不能在临床广泛使用。现有研究证明，人工肝支持系统（artificial liver support system， ALSS）可以通过体外装置暂时替代肝脏的部分功能，有效清除肝衰竭患者体内毒素及炎症介质，为肝细胞再生创造条件，为肝功能恢复及肝移植争取时机，是肝衰竭的有效治疗方法。人工肝技术分为生物型、非生物型及混合型，目前在临床上广泛应用的是非生物型人工肝（non-biological artificial liver，NBAL），其包括血浆置换（plasma exchange， PE）、血液/血浆灌流、双重血浆分子吸附系统（double plasma molecular absorption system，DPMAS）、血液透析滤过（hemodiafiltration，HDF）、血浆透析滤过（plasma diafiltration，PDF）、分子吸附再循环系统（molecular absorbent recirculating system，MARS）等模式［4］。生物型人工肝（biological artificial liver，BAL）能更好地模拟肝脏的合成、解毒、代谢等生物学功能。随着科学技术的发展，种子细胞来源、培养及生物反应器的构建等相关技术都取得实质性的进展，BAL 相关临床研究也在积极开展。本文针对NBAL技术的优化及BAL 的相关进展进行总结和探讨，以期对未来人工肝技术的临床应用与研究提供参考。

1 NBAL治疗的时机

肝衰竭进展快速，预后不佳。《肝衰竭诊治指南（2018年版）》［1］指出人工肝治疗肝衰竭的总体原则为“早诊断、早治疗”，具体治疗时机还应根据疾病的病理生理特点及病情的动态变化进行选择。ALSS 在前、早、中期肝衰竭患者中的使用已在《人工肝血液净化技术临床应用专家共识（2022年版）》中得到认可［5］，其有效性也在临床研究中得到验证。Li等［6］对ALSS 治疗HBV 相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）进行Meta分析，结果显示ALSS治疗的患者28天、90天和270天总生存率高于标准治疗组。有学者［7-8］对早期、中期的HBV-ACLF患者分别进行了研究，发现早期HBV-ACLF患者通过DPMAS序贯低剂量PE 治疗后4 周总体生存率显著升高，而中期HBVACLF患者治疗后4周总体生存率无明显改善，这表明在HBV-ACLF患者中人工肝治疗应尽早开始。

大量研究表明，PE 可以改善急性肝衰竭（ALF）、ACLF 患者的预后。在全病因ACLF 患者中，PE 对ACLF 2 级患者预后的改善优于ACLF 1 级和ACLF 3 级［9］。在HBV-ACLF 患者中，基于PE 的ALSS 治疗同样对ACLF 2级患者生存率有显著改善［10］。ACLF 1 级患者的肝功能在经过标准内科治疗后有可能会恢复，对其进行PE 治疗并不能实现最大获益；ACLF 3级患者因器官衰竭数量多，故PE 治疗效果欠佳。PE 在ACLF 2级患者中使用可实现最大获益。

终末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）评分不同的患者PE 治疗效果也有差异。MELD评分在30～40分的HBV-ACLF 患者经过以PE 为基础的ALSS 治疗生存率改善最为显著［9］。吴慧慧团队［11］以MELD评分中位数为界限将HBV-ACLF患者分为高评分组和低评分组，并评估两组患者ALSS 治疗效果，结果显示，低评分组临床症状较高评分组患者明显改善。

笔者研究团队［12］基于ACLF 的动态变化提出新的临床分型，将其分为5种类型，其中A型快速进展型病情进展较快，人工肝治疗效果较差或没有干预时机；B型快速恢复型可能不需要人工肝治疗或较少次数的人工肝治疗即可恢复；C 型缓慢进展型依赖人工肝治疗的次数较多，但效果可能不理想，应争取多次人工肝治疗，为肝移植争取时间；D型缓慢恢复型人工肝治疗效果好，应加强人工肝治疗；E 型缓慢持续型患者接受人工肝治疗后病情可能会加快恢复，但疗效不肯定，应根据患者的自身条件选择人工肝治疗次数。

林建辉团队［13］对PDF 的治疗时机进行回顾性研究，结果显示，在肝衰竭患者的治疗过程中，72 h 后启动PDF 治疗会增加发生院内不良预后的风险，且这种风险随着时间的延长逐步增加，即患者确诊HBV-ACLF 后超过72 h 启动PDF 治疗，每增加1 h，院内不良结局风险增加4%，这提示对HBV-ACLF 患者72 h 内启动PDF 治疗能够改善预后。安薪宇团队［14］根据临床表现及实验室检查将ACLF 患者分为好转组和恶化组，分别比较ALSS治疗前两组患者的细胞因子水平，发现好转组的人β防御素-1（human beta-defensin-1， HBD-1）、干扰素-α（interferon， IFN-α）水平明显低于恶化组，甲胎蛋白水平明显高于恶化组，进而分析发现 HBD-1、IFN-α 和甲胎蛋白为ACLF患者短期预后的独立危险因素，ACLF患者HBD-1、IFN-α 水平越高，甲胎蛋白水平越低，预后越差。临床医生可根据ACLF患者血清中的细胞因子水平评估患者的短期预后，在排除感染后尽早启动人工肝治疗。

肝衰竭患者的ALSS 治疗需要临床医生具备丰富的经验，依据“早诊断、早治疗”的总体原则，结合患者的疾病进程、严重程度，应用各种预后预测模型，根据疾病动态演变评估患者预后，选择恰当治疗时机，为患者争取最大获益。

2 NBAL的模式及其优化

2.1 PE 及其优化 PE 能改善肝衰竭患者的预后，有研究［15］将PE 与成分血浆分离吸附系统比较，发现PE 能改善全身炎症反应综合征，延缓多脏器功能衰竭，提高30 天生存率。也有研究［9］表明，与标准疗法相比，PE 能提高ACLF患者30天生存率，但其对90天生存率无明显改善。一项Meta 分析［16］显示，在全病因ACLF 患者中，PE组相较于标准治疗组3个月总体生存率显著升高。

根据目标清除物的半衰期及清除率，有学者［17］提出了高容量血浆置换（high-volume plasma exchange， HVPE）。与标准内科治疗相比，HVPE 能改善ALF 患者的无移植生存率，同时也能减轻炎症和降低序贯器官衰竭（sequential organ failure assessment， SOFA）评分。该研究并未将HVPE 与PE 比较，故HVPE 的有效性还需要进一步探讨。

由于新鲜冰冻血浆中含枸橼酸偏碱性，因此单纯PE可能会加重肝性脑病，且单纯PE 治疗对水溶性毒素清除效果差，优化PE 的治疗模式是非常有必要的。PE 联合血浆灌流能显著改善肝性脑病等并发症，促进器官功能恢复，延缓器官衰竭及并发症的发生，提高HBV-ACLF患者的28 天和90 天生存率，其对出现两种及以上器官衰竭和并发症的患者生存率提高更加显著［18］。

目前血浆资源日趋紧张，这也成为PE 受限的原因之一，使用安全的代血浆制品是有效的解决方法。临床常用的血浆替代品包括人血白蛋白、羟乙基淀粉、右旋糖酐及晶体液等。笔者团队［19-20］的研究表明在使用PE治疗肝衰竭患者时，应用血浆+羟乙基淀粉作为置换液可以提高治疗后即刻胆红素的清除率，但其对治疗后胆红素的反弹幅度无明显改善，同时会造成白蛋白减少，在治疗后应注意及时补充白蛋白；血浆紧缺时，除了在PE初始阶段采用血浆代用品以外，还可以根据具体情况采用吸附、灌流、滤过、成分血浆分离（如PDF）、半量PE联合DPMAS、无血浆模式血液置换、基于基线生化指标可调节的人工肝组合模式等方法。

2.2 HDF 及其优化 HDF 将血液滤过和血液透析综合起来，通过弥散清除小分子物质、对流超滤中分子物质，能有效清除血液中的有害物质，其作用效果与透析液的流速有关。一项日本的研究［21］比较了不同透析液流速的HDF对暴发性肝炎的影响，在PE 治疗的基础上，透析液流速为500 mL/min的患者意识恢复率高于300 mL/min的患者，采用高容量透析液的在线血液透析（on-line hemodiafiltration，OLHDF）患者意识恢复率可达92.9%。在生存率方面，透析液流速为500 mL/min 的治疗模式和OLHDF 也体现出了优势。新型人工肝模式在线连续血液透析滤过对血氨、尿素氮、肌酐都有显著的改善作用，可以促进ALF 伴肝性脑病患者意识恢复，但对生存率的影响仍不明确。同时，该模式中透析液可以当作置换液，能在一定程度上节省费用，但其对操作的无菌要求更高［22］。

2.3 PDF 及其优化 PDF 将选择性PE 与透析结合起来，选择不同蛋白筛选系数的血浆成分分离器，滤过部分蛋白结合毒素及水溶性中小分子溶质，同时补充凝血因子等生物活性物质［5］。研究［23］显示，连续性血浆透析滤过（continuous plasma diafiltration， CPDF）能改善ALF 患者的肝功能，并对肾脏、肺和血流动力学产生有益的影响，改善SOFA 评分，这表明CPDF 可用于伴有血流动力学不稳定的ALF 患者。笔者团队［24］的研究显示在不影响治疗有效性及安全性的前提下，PDF 治疗4 h 和6 h 的患者胆红素和转氨酶下降均无统计学差异，提示临床工作中可通过缩短PDF的治疗时间以增加患者的耐受性。

2.4 DPMAS 及其优化 DPMAS 是一种不需要外源性血浆的NBAL模式，可以清除血浆中的胆红素、炎症介质及肝性脑病相关毒素。与PE 相比，接受DPMAS 治疗的HBV-ACLF患者其12周生存率无明显差异［25］，但DPMAS的优势在于不受外源性血浆来源的限制。DPMAS 无法补充凝血因子而PE 可以补充凝血因子，PE 有加重肝性脑病的风险而DPMAS可以清除肝性脑病相关毒素，故这两种模式可以互相取长补短，DPMAS 序贯PE 目前也成为临床常用的人工肝组合模式。DPMAS 序贯低流量PE不仅可以降低治疗费用、减少血浆用量，同时在降低胆红素、改善凝血功能方面均优于内科治疗组，其12 周的累积生存率亦高于内科治疗组［8］。DPMAS 序贯半量PE 相较于PE 可能更有效地降低ACLF 患者的胆红素并节省血浆，减少胆红素反弹，提高HBV-ACLF 中晚期患者的28天生存率［26］。在HBV-ACLF患者中，DPMAS+PE 治疗组28 天好转率和12 周存活率均显著高于血浆胆红素吸附+PE组［27］。

2.5 MARS 及其优化 MARS 是一种基于白蛋白透析的人工肝治疗模式，虽能够有效降低水溶性毒素，对稳定血流动力学有积极作用，但对于患者远期预后的改善效果仍不明确。同时，由于其需要大量白蛋白，耗材费用较高，且主机需要与透析或血滤机配合使用，故没有在国内广泛使用。

欧洲的DELPHI 共识［28］对MARS 治疗肝衰竭的安全性及有效性予以认可。在对乙酰氨基酚引起的ALF患者中使用MARS 疗法可改善其21 天预后。在全病因ALF患者中，MARS能使水溶性毒素、亲脂性物质及炎症因子减少，改善肝性脑病，稳定血流动力学，治疗频率≥3次时效果较显著，但其并不能改善6～12个月生存率，且不建议在晚期合并多器官衰竭的ALF 患者中使用。该共识推荐在对特利加压素和白蛋白治疗无反应的肝肾综合征患者，及24～48 h 标准治疗后仍有肝性脑病的失代偿性肝硬化、ACLF、继发于ACLF 的进行性胆汁淤积患者中使用MARS人工肝治疗，但也指出其对28天及90天预后无明显改善。一项单中心研究［29］结果证实了MARS能显著降低总胆红素，改善ACLF 和ALF 患者的肝性脑病。目前许多研究显示MARS 可以有效降低肝衰竭患者的血清学指标并改善肝性脑病的严重程度，其对21天生存率的改善作用也被认可，但其远期预后是否改善仍不明确，这可能与肝衰竭患者病情危重，肝功能恢复较慢有关。

2.6 新型的人工肝技术 DIALIVE 是一种基于ACLF病理生理机制开发的新型人工肝技术，能够去除功能失调的白蛋白并补充等量白蛋白，也能吸附内毒素和炎症因子。欧洲学者［30］通过研究以酒精性肝病为基础的ACLF 患者，发现相比于标准治疗，DIALIVE 可以改善白蛋白功能，促进ACLF 恢复，同时缩短治疗时间。在治疗第10 天进行评估，DIALIVE 可显著降低患者CLIF-C OF评分和CLIF-CACLF评分，但该研究并没有表明DIALIVE能否改善预后，这是需要进一步探讨的问题。

CytoSorb是一种体外血液净化装置，主要用于感染性休克和其他炎症性疾病，有学者指出ALF 是其使用的第三大适应证，可以大量清除胆红素。基于此观点，Popescu等［31］将CytoSorb 与MARS 进行对比，发现其在降低胆红素和转氨酶方面确有优势，能够改善肝功能，但同时也会造成血小板和血红蛋白下降。新型人工肝技术还需要在更多的临床应用中去验证其有效性及安全性。

2.7 抗凝方案的优化 肝衰竭患者凝血功能差，使用抗凝剂会增加出血风险或诱导血小板减少。目前主要的抗凝方式包括全身肝素抗凝、体外肝素抗凝和低分子肝素抗凝在内的肝素抗凝法及局部枸橼酸抗凝法。枸橼酸抗凝在肝衰竭患者人工肝治疗中的应用曾有较大争议，白浪教授团队［32］在应用DPMAS+PE 治疗肝衰竭患者时发现，相较于肝素抗凝，局部枸橼酸抗凝导致阴离子间隙水平显著变化，发生枸橼酸蓄积可能性更高，但两组患者的酸碱状态改变趋势并无显著差异，局部枸橼酸抗凝对DPMAS+PE 治疗肝衰竭患者有效且安全，但如果存在严重低氧血症（动脉氧分压＜60 mmHg）和组织灌注差（血压＜90/60 mmHg），则不推荐使用枸橼酸抗凝［5］。白浪教授团队［33］在后续研究中发现，PE 联合血浆吸附治疗的HBV-ACLF 患者中，是否发生枸橼酸蓄积并不是影响90天预后的独立危险因素，患者自身肝病的严重程度对预后影响更大。已有Meta 分析［34］显示人工肝治疗中局部枸橼酸抗凝对肝衰竭患者是有效且安全的。在人工肝治疗中，应根据患者病情制订个体化的抗凝方案，在治疗过程中密切检测、及时调整抗凝剂量有助于降低并发症的风险，局部枸橼酸抗凝可以作为人工肝治疗肝衰竭的抗凝新选择。

此外，笔者团队［35］对新型抗凝剂萘莫司他在人工肝中的应用进行了探索，研究结果显示萘莫司他在DPMAS治疗过程中抗凝效果良好，具有局部抗凝的特点，对人体凝血功能的影响小，出血风险小，安全性好。

3 BAL研究现状与进展

NBAL 虽然能在一定程度上替代肝脏的解毒功能，但无法进行合成代谢。对比传统的NBAL，BAL 在理论和应用方面具有良好的潜力，不仅可以吸附、代谢有毒物质发挥解毒作用，且能模拟肝脏合成蛋白质等有益物质，促进肝脏恢复，其主要包括种子细胞、生物反应器和辅助体外循环装置三个部分。目前，BAL 技术蓬勃发展，得到了国内外学者的广泛关注，种子细胞的来源与培养、生物反应器的研发已经有了实质性进展，BAL 技术有巨大的临床潜力及光明的发展前景。

BAL 的关键在于种子细胞，种子细胞来源发展差异较大。动物源性肝细胞（通常是猪肝细胞）已经应用于早期的BAL 系统，但其有病毒感染的风险，目前已被欧洲禁用［3］。肿瘤来源的肝细胞主要有HepG2 细胞系、HepaRG 细胞系和C3A 细胞系，其中C3A 细胞系已经被应用于ELAD系统并进行临床试验。肿瘤来源的肝细胞可在体外大量培养，以满足BAL 细胞播种密度的要求，但如果发生泄漏就会有致癌的风险。人原代肝细胞（primary human hepatocytes， PHH）被认为是最优质的细胞来源，但其来源有限，体外培养不易且可能会失去生物学功能。目前，已有团队研制出新的培养基，能够实现PHH 体外大量扩增［36］。永生化的肝细胞是将永生化基因导入PHH生成的细胞系，能够解决PHH在体外大量增殖受限的问题。其中永生化的肝前体样细胞（iHepLPC）已经被应用于BAL 并进行动物实验。多能干细胞能够被诱导分化为成熟肝细胞，但其生产过程昂贵又费时，还需要稳定的生物反应器维持细胞表型及生物活性。施晓雷教授团队［37］提出了一种新型的仿生BAL，使用了多能干细胞衍生肝细胞（hiPSC-Hep），并在ALF兔模型中较好地模拟了肝细胞的功能。直接将人成纤维细胞重新编程为肝细胞，可以快速生成具有成熟功能和高度扩展性的人源诱导肝样细胞（hiHep），该细胞系应用于BAL 治疗ALF猪模型的安全性和有效性已经被证明［37］。

生物反应器是BAL 的另一核心要素，在维持细胞稳定增长、保证细胞正常发挥功能方面具有重要作用。常见的反应器有中空纤维反应器、灌流/支架式反应器、微囊悬液式反应器和平板型生物反应器，各种反应器各有利弊。中空纤维反应器有内腔和外腔，细胞黏附于外腔，通过生物膜与血液进行物质交换。这种方式能降低血液灌注对肝细胞的剪切力，避免异种细胞间发生免疫反应，但同时也会造成细胞分布不均，物质交换效率下降的问题。目前临床研究中的ELAD和HepAssis2®都是基于中空纤维反应器构建的。灌流/支架式反应器借助灌注床或支架培养肝细胞，使细胞与血液直接接触，增加了物质转运，促进三维结构的形成，能容纳更多细胞，但该反应器中血液灌注不均匀，易发生堵塞。微囊悬液式反应器使用半透膜将肝细胞包裹起来制作成多孔微胶囊，然后进行灌注培养，其优点是所有细胞的微环境相同，有大量细胞培养的空间，免疫隔离效果好；缺点是细胞稳定性差，物质交换能力差［3，38］。平板型生物反应器是将细胞种植在平板上培养，其优点是细胞分布均匀，微环境一致，血浆成分和细胞直接接触，物质交换能力在几种结构中最高，但表面积与体积之比下降，细胞承载能力低，可能存在剪切力大及免疫损伤肝细胞的风险。

目前，有多家研究中心开展对BAL 的研发。ELAD是一种以C3A 肝癌细胞系为种子细胞的BAL，使用中空纤维型反应器，已在多项临床试验中被使用。一项国内的随机多中心研究［39］对ELAD 的有效性及安全性进行评估，该研究以ACLF 患者为基础，所有患者均接受PE和血液滤过治疗，ELAD 组后续接入ELAD 治疗，对照组为标准内科护理。结果显示，ELAD 能够显著清除胆红素并改善28天无肝移植生存率，且在患者中表现出良好的耐受性。国外学者［40］以酒精性肝炎患者为基础研究ELAD 的有效性，结果显示ELAD 组相较于标准治疗组并没有明显改善总体生存率。相比于国外的研究，国内研究纳入的ACLF患者大多以乙型肝炎为病因，ELAD对生存率的影响可能与患者的疾病基础相关，还需要更多的临床研究去验证。

HepAssis2®以HL2细胞为种子细胞，该人工肝技术使用中空纤维式反应器。HL2细胞是一种非诱导自发性人源永生化肝细胞系，具有良好的肝功能和极强的增殖能力。武汉的研究团队以肝衰竭人群为基础研究HepAssis2®的有效性，结果显示该技术能更好地降低胆红素水平，减少胆红素反弹，显著改善患者的无移植生存率。

鄢和新教授团队［41］研发了以iHepLPC 为种子细胞、以支架反应器为载体的Aliver 人工肝系统，该系统实现了iHepLPC 在体外的大量扩增，保持了肝细胞的生物学功能，在治疗ALF 猪模型过程中达到了积极的效果。结果显示，Aliver 可合成尿素，代谢血氨，分泌肝细胞生长因子、白蛋白等，促进了肝细胞再生和肝脏恢复，显著提高动物存活率。

惠利健教授团队［42］设计了以hiHep 为种子细胞的人工肝系统hiHep-BAL，其能够改善ALF猪的肝功能，进而提高存活率。该团队后续的研究［43］显示，hiHep-BAL治疗在肝切除术后肝衰竭动物模型中有显著的存活益处，能够促进肝功能恢复及肝脏再生。将hiHep-BAL 用于治疗7 例行扩大肝切除术的患者，发现患者对治疗耐受性良好。基于前期的研究成果，使用多层平板生物反应器的HepaCure人工肝系统得以研发。近期，首都医科大学附属北京佑安医院开展了首例HepaCure 的临床研究，结果显示，HBV-ACLF患者对内科治疗联合HepaCure耐受性良好，且在14天的随访观察期间没有发生严重不良反应，肝功能及凝血指标逐渐好转。

4 总结

随着科学技术的发展进步，ALSS 成为治疗肝衰竭患者的重要手段，NABL 已经被广泛应用于临床，BAL 也在飞速发展并取得了实质性的进步。国内外不同研究在人工肝对于肝衰竭患者生存率的影响方面结果不一致，在解读这些研究结果时，应该充分考虑到不同研究的纳入标准不尽相同，采用的人工肝治疗模式也不尽相同等差异性因素，并且评价人工肝效果时除了评估患者生存率，还应评估其对延长患者等待肝移植时间的作用。在应用NBAL治疗时，个体化治疗是必然趋势，应根据患者的疾病具体情况选择恰当的治疗时机、合适的治疗模式，制订合理的治疗参数，及时评估患者预后，争取患者获益最大化。BAL可以补充NABL缺乏的合成、代谢等肝脏功能。国内已有多家研究中心开展了BAL 的研究工作，取得了令人鼓舞的成果，笔者期待BAL进一步的开发和临床应用，希望在未来能够使更多肝衰竭患者受益。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：周莉、杨颜榕负责查阅和分析资料，撰写论文；陈煜负责选题，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。