膏摩法对膝关节纤维化模型兔抗炎作用研究

黄银僖, 王 程, 摆 雪, 田育魁, 郭 蕾, 方 锐

(1新疆医科大学第四临床医学院, 乌鲁木齐 830054; 2新疆医科大学附属中医医院关节外科, 乌鲁木齐 830099)

关节僵硬是常见的术后并发症,主要表现为关节活动范围受限,并伴有关节变形、局部疼痛、感觉异常等症状[1-2]。关节僵硬的主要病因为关节周围软组织过度纤维化[3-4]。膏摩法是一种重要中医外治方法,古代医家善于运用不同膏方治疗各种内外科疾病[5]。本研究膝痹膏源自《千金翼方》苍梧道士陈元膏[6],主要用于骨伤科疾病的治疗。课题组在前期的研究中发现膝痹膏能够有效改善膝骨性关节炎患者关节疼痛和关节功能活动度,降低炎症细胞因子TNF-α水平,促进转化生长因子TGF-β的修复[7],且IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的致纤维化因子[8]。本研究在前期研究的基础上进一步研究膏摩法对膝关节术后纤维化模型兔血液中白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,并观察瘢痕组织的纤维化程度。

1 材料与方法

1.1 实验对象无特定病原体(SPF)级雄性新西兰大白兔30只,体重2.0～3.0 kg,由杭州医学院实验动物中心(动物质量合格证号:20230713cezz06069995111,生产许可证号码:SCXK(浙)2019-0002)提供。实验于杭州医学院实验动物中心SPF级动物实验室进行(SYXK(浙)2019-0011),室温(22±2)℃,相对湿度60%～80%,昼夜节律,自由进食、饮水。

1.2 实验药物膝痹膏所需当归、秋水仙、黑附片、干姜、细辛、白芷均购于新疆维吾尔自治区中医院药学部,经检验符合《中华人民共和国药典(2015版)》之要求。膏剂由新疆医科大学新疆名医名方与特色方剂实验室制备。

1.3 主要实验试剂舒泰50(8SKGA,维克公司),盐酸赛拉嗪注射液(20220301,圣达动物药品有限公司),甲醛(F809702,麦克林公司)。Rabbit IL-1β ELISA Kit(YJ027836,上海酶联公司),Rabbit IL-6 ELISA Kit(YJ027844,上海酶联公司),Rabbit TNF-α ELISA KIT(YJ028087,上海酶联公司),苏木素染液(CTS-1097,福州迈新生物技术开发有限公司)。伊红染液(ZLI-9613,北京中杉金桥生物技术有限公司),中性树胶(货号ZLI-9555,北京中杉金桥生物技术有限公司),DEPC(D60029,Amresco公司),TRIzolTMReagent(15596026,Ambion公司)。

1.4 主要仪器电子天平(DY15K,上海菁海仪器有限公司),精密电子天平(FA2004N,上海菁海仪器有限公司),台式低速离心机(SF-TDL-5C,上海菲恰尔分析仪器有限公司),恒温水浴锅(DK-80,上海精宏仪器厂),液氮罐(YDS-50-125,成都金凤仪器厂),-20℃低温冰箱(BCD-249LCK,合肥美菱公司)-80℃低温冰箱(DW-HL388,合肥美菱公司),微量振荡器(MM-2,合肥美菱公司),微量分光光度计(Nano-100,杭州奥盛公司)。

1.5 模型建立称重实验兔,手术时以舒泰50(5 mg/kg)+盐酸赛拉嗪(10 mg/kg)肌肉注射将兔麻醉,待麻醉满意后(麻醉满意的动物表现为:呼吸规律平稳,全身肌肉松弛,角膜反射迟钝,钳夹兔子皮肤无反应或较轻),将兔子仰卧于手术台上,将其四肢固定后对兔左侧膝关节备皮、碘伏常规消毒手术区域、铺无菌手术单,沿兔膝部正中做一纵形切口,逐层切开皮肤、皮下组织,暴露双侧股骨踝,用电钻分别在股骨踝内外侧去除约10 mm×10 mm的皮质骨(深度约3 mm),暴露松质骨,手术过程中不损伤周围关节软骨。使用生理盐水冲洗伤口,并对手术区域充分止血后逐层缝合伤口。并用克氏针将右侧膝关节固定于完全屈曲位。术后局部酒精纱布外敷手术切口处[9]。模型建立标准:造模关节呈屈曲状态,瘢痕组织HE病理染色有成纤维细胞过度增殖。本研究模型组、推拿组、涂膏组、膏摩组,共24只均造模成功。

1.6 分组及干预

1.6.1 动物分组 选取30只SPF级雄性新西兰大白兔,按照随机数字表法随机分为5组,每组6只,依次设为空白对照组、模型组、推拿组、涂膏组、膏摩组。

1.6.2 干预 空白对照组:常规饲养实验兔,不进行任何实验。模型组:术后1周,取3 g凡士林均匀涂抹于瘢痕区并用无菌纱布包扎,1 h后祛除辅料。每天1次,连续4周。涂膏组:将凡士林替换为膝痹膏。推拿组:术后1周,进行推拿干预。实验兔取仰卧位,沿股四头肌至胫骨及髌骨两侧用捏、拿、按、揉等手法往返治疗,重点在髌骨两侧,然后按、揉小腿前外侧,时间约4 min。然后取俯卧位,在腘窝部、大腿下端、小腿上端用捏、拿、按、揉等手法往返治疗,重点在腘窝部(委中穴)时间约3 min。继予3 g凡士林均匀涂抹于瘢痕,在两侧膝眼施以按、揉手法,时间约1 min,干预结束后用无菌纱布包扎,1 h后去除敷料。每天1次,连续4周。膏摩组:方法同推拿组,将凡士林替换为膝痹膏。

1.7 标本采集与预处理干预4周后收集一次耳缘静脉血,分离血清,转存-80度冰箱。使用空气栓塞法处死实验兔,从每只实验兔的膝关节骨缺损区获取瘢痕组织,一式2份,一份保存于液氮中,转存-80度冰箱;另一份保存于4%多聚甲醛中,常温保存。

1.8 检测指标与方法取各组血清样本,根据试剂盒说明书要求处理样本后,采用酶联免疫吸附法(ELISA) 法检测各组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量,具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。HE染色实验:瘢痕组织取材后用生理盐水冲洗干净血水后置于10%中性福尔马林溶液中固定。将固定好的组织常规脱水,二甲苯透明, 石蜡包埋,制成4 μm的切片,采用苏木精-伊红(HE)染色, 中性树胶封片,光学显微镜下读片。炎症评分: 0分:正常;1分:轻度炎症,光镜下观察有1个聚集物或少量散在炎性细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞及浆细胞)浸润;2分:中度炎症,2个或2个以上的白细胞聚集物;3分:重度炎症,炎细胞大量浸润,大量白细胞聚集,分散浸润明显。

2 结果

2.1 各组IL-6、IL-1β、TNF-α含量比较与空白对照组相比,造模后各组外周血中IL-6、IL-1β、TNF-α含量均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,膏摩组IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与推拿组比较,膏摩组IL-6、IL-1β含量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),但TNF-α含量无明显变化。与涂膏组比较,膏摩组IL-6、IL-1β、TNF-α差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 干预4周后各组IL-6、IL-1β、TNF-α含量比较

2.2 各组瘢痕组织炎症评分比较干预4周后,空白对照组、模型组、涂膏组、推拿组、膏摩组炎症评分分别为0、3、1、2、1分。与空白组比较,造模后各组炎症评分差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,推拿组、涂膏组、膏摩组炎症评分降低(P<0.05),且推拿组炎症评分高于涂膏组、膏摩组(P<0.05),但涂膏组与膏摩组炎症评分差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组瘢痕组织HE染色比较光镜下观察可见,模型组出现增生伴玻璃样变的纤维结缔组织,部分区域纤维肉芽组织增生,可见较多成纤维细胞,间质大量急、慢性炎细胞浸润;与模型组比较,涂膏组、推拿组、膏摩组纤维组织及纤维肉芽组织增生程度降低,间质急、慢性炎细胞及成纤维细胞数量减少;与推拿组比较,涂膏组、膏摩组增生性病变降低,且膏摩组低于涂膏组。见图 1。

组别HE染色(X100)HE染色(X400)空白对照组模型组涂膏组推拿组膏摩组

3 讨论

膏摩法是医者用来预防治疗关节僵硬的方法之一。膝痹膏方由《千金翼方·卷十六·诸膏第三》苍梧道士陈元膏化裁而来,“风百病方:当归丹砂,细辛,川芎……以地黄汁,打醋渍药一宿,猪脂中合煎之十五沸,膏成去膏成去滓,纳丹砂等末熟搅”及“有患膝冷痛,摩之五日愈”之记载[6]。新疆医科大学王新军教授根据新疆独特的地方气候特征对膝痹膏进行化裁添加秋水仙、黑附片等中药,最终形成具有新疆特色的复方制剂[10]。

关节僵硬是临床关节术后面临的疑难问题,严重影响了患者的术后生活质量。其发病机制复杂[11],现代研究认为炎症反应是启动并促进纤维化进程的关键环节[12]。有研究报道,推拿干预对肩关节周围炎模型兔有效地拮抗了关节囊纤维化并改善了肩关节的活动度[13]。膏摩法是一种推拿手法与中医外用膏药相结合使用的中医特色外治疗法。历代医家使用不同的膏摩方治疗内外妇儿各类疾病,但在现代研究中鲜有关于膏摩法防治关节术后过度纤维化的报道。本研究显示,膏摩法能有效降低膝关节纤维化模型兔外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α含量,且优于单纯推拿,但与单纯涂膏相比外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α含量差异无统计学意义;空白对照组、模型组、涂膏组、推拿组、膏摩组炎症评分分别为0、3、1、2、1分,与模型组比较,推拿组、涂膏组、膏摩组炎症评分降低,且推拿组炎症评分高于涂膏组、膏摩组,但涂膏组与膏摩组炎症评分差异无统计学意义;瘢痕组织HE染色结果提示涂膏组、膏摩组两组增生性病变要轻于推拿组;膏摩组增生性病变轻于涂膏组。

综上,膏摩法能够更好地干预瘢痕组织的炎性反应,从而抑制了瘢痕组织的过度纤维化,对关节术后僵硬的发生起到了预防作用。但本研究对膏摩法预防关节僵硬仅做了初步探讨,样本量较少,且没有进行相关信号通路的研究结果支持。今后的研究,应开展大样本、加入信号通路的检测,以期为中医药防治关节僵硬提供更多理论依据。