酒煎瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病多靶点作用机制的交互网络分析

刘明阳，张洋，高丽，董振飞，曾以德

山东中医药大学，山东 济南 250355

冠心病（CHD）是由冠状动脉粥样硬化引发管腔狭窄或闭塞所导致的器质性心脏疾病[1]。《中国心血管健康与疾病报告》2020[2]显示，中国心血管病患病率处于持续上升阶段，截至2020 年，CHD 患者数量可能超1 139 万。《素问·脏气法时论》记载：“心病者，胸中痛，胁支满，胁下痛，膺背肩胛间痛。”《类证治裁·胸痹》记载：“胸痹，胸中阳微不运，久则阴乘阳位，而为痹结也。”后世常将“阳微阴弦”看作CHD 的病机，胸中阳气衰微日久，寒邪、水饮、痰浊、血瘀等邪实上乘，痹阻胸阳，不通则痛。《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》记载：“胸痹不得卧，心痛彻背者，瓜蒌薤白半夏汤主之。”针对痰湿瘀滞、阳气不振的胸痹，可用具有通阳行气、化痰散结功效的酒煎瓜蒌薤白半夏汤进行治疗。研究表明，瓜蒌薤白半夏汤治疗CHD 痰瘀互结证取得了良好疗效[3]。杨卫明[4]对56 例CHD 患者使用瓜蒌薤白半夏汤治疗，临床疗效优于常规治疗方案。酒在本方中体现出了散痹通阳、载药上行等作用。本研究遵循《金匮要略》中的方法，使用瓜蒌、薤白、清半夏、米酒同煮，通过临床观察证实酒煎疗效更优。中药方剂的药物成分多不明确，作用机制往往不清楚，限制了中医药的发展，也难以体现中药复方多靶点、多通路的作用特点[5]。网络药理学可以阐述中药复方多成分、多靶点的作用机制，有效弥补既往研究中单靶点、低选择性的不足[6]。但是在研究方法中仍存在一些技术性缺陷，严重影响网络药理学虚拟筛选的准确性[7]。近年来，质谱分析技术发展迅速，其可更客观地分析中药复方煎剂中的化学成分[8]。本研究采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪（UPLC-Q-TOF/MS）分析酒煎瓜蒌薤白半夏汤的化学成分，运用网络药理学研究方法和分子对接手段，对该方治疗CHD 的作用机制进行分析，为深入探究酒煎瓜蒌薤白半夏汤治疗CHD的药理作用及治疗机制提供借鉴和参考。

1 实验材料

1.1 仪器与试剂1260 型高效液相色谱仪和6230 型液相质谱联用仪（美国Agilent 公司），HALO 90A C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7µm，美国AMT 公司），FA1604N 型0.1 mg 电子天平秤（上海精密科学仪器有限公司）， Centrifuge 5420 微量离心机（德国Eppendorf 公司）， 明澈D24 UV 纯水仪（Merck Millipore），YM-080S 超声仪（深圳市方奥微电子有限公司）。甲醇、乙腈、甲酸（上海麦克林生化科技股份有限公司），纯度均为LC-MS 级。

1.2 中药饮片瓜蒌、薤白、清半夏饮片均由河北康益强药业有限公司生产，所有药材均由山东中医药大学药学院中药鉴定教研室梁晓东副教授进行鉴定和评估。

2 研究方法

2.1 酒煎瓜蒌薤白半夏汤制备精确称取瓜蒌24 g、清半夏12 g、薤白9 g 及米酒700 mL。上述材料置于煎药砂锅中浸泡1 h 后煎煮1 h，倒出药液，纱布过滤，再次加入米酒700 mL，重复以上操作。合并2 次滤液并浓缩至250 mL，制备成酒煎瓜蒌薤白半夏汤标准煎液[3]。

2.2 质谱供试液制备取酒煎瓜蒌薤白半夏汤标准煎液1 mL，放入真空冷冻干燥机中，冷阱盘管温度设置为-80 ℃，真空度1 Pa 以下。48 h 后取出冻干样品，精密加入100% 甲醇1 mL，超声40 min，12 000 r/min 离心12 min，取上清液，过0.22 µm 微孔滤膜，即得酒煎瓜蒌薤白半夏汤质谱供试液。

2.3 液质联用成分分析①色谱条件。HALO 90A C18 色谱柱，流动相-0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B）梯度洗脱（0～10 min，2%～10%B；10～20 min，10%～20%B；20～25 min，20%～45%B；25～30 min，45%～95% B；30～35min，95%～100% B），流速0.3 mL/min，柱温25 ℃，检测波长为265 nm、254 nm、310 nm、325 nm，进样量2 µL。②质谱条件。采用电喷雾离子源（ESI），离子源电压3.2 kV，毛细管加热温度为350 ℃，雾化气压35 psig，碎裂电压175 V，离子源温度350 ℃，干燥气流量8 L/min，质谱扫描范围m/z50～1 500，鞘气、辅助气均为氮气。按照以上条件进行设置，对正、负离子模式分别检测，获取总离子流图。

2.4 酒煎瓜蒌薤白半夏汤化学成分鉴定通过查询中国知网（CNKI）、PubMed 数据库组建瓜蒌、薤白、清半夏的化学成分数据库，通过中医药综合数据库（TCMID）、 有机小分子生物活性数据库（PubChem）、中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索中药相关化学成分信息，通过正离子模式下[M+H]+、[M+Na]+及负离子模式下[M-H]-、[M+HCOO]-加合分子离子的精确理论质荷比，对色谱峰各成分进行精确指认。

2.5 酒煎瓜蒌薤白半夏汤化学成分筛选与分子结构获取通过PubChem 数据库对酒煎瓜蒌薤白半夏汤组成药物的化学成分进行类药性识别，筛选出结构明确、有药理作用的成分作为本方的活性成分。通过PubChem 数据库检索活性成分对应的分子结构，将分子结构下载并保存为SDF 格式。

2.6 酒煎瓜蒌薤白半夏汤作用靶点筛选将“2.5”中得到的SDF 格式文件导入Swiss 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），研究物种选择“Homo sapiens”，检索出活性成分的作用靶点，去重后即为酒煎瓜蒌薤白半夏汤的作用靶点。

2.7 疾病相关靶点筛选以“coronary heart disease”为关键词在Gene Cards 数据库（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/）中进行检索，Score≥10 作为筛选的条件。将结果取交集后获得CHD 的相关靶点。

2.8 药物-疾病作用靶点筛选在韦恩图绘制工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/#/）中分别录入酒煎瓜蒌薤白半夏汤和CHD 的作用靶点，绘制韦恩图，取交集后的共同靶点即为酒煎瓜蒌薤白半夏汤治疗CHD 的作用靶点。

2.9 药物-活性成分-靶点网络模型构建及分析将中药的活性成分及获取的潜在基因作用靶点分别导入Cytoscape 3.8.2 软件，构建中药-活性成分-靶点互作网络，使用Network Analyzer 功能对主要活性成分进行分析，节点的大小代表度值（degree）的高低。

2.10 蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络建立及功能富集分析将作用靶点上传至Metascape 在线分析网站（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），建立PPI 网络及基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，并绘制气泡图进行可视化。将GO 富集分析中的生物过程、细胞成分、分子功能的相关靶点录入OmicStudio 网站（https：//www.omicstudio.cn/tool）进行Upset 分析并绘图，筛选酒煎瓜蒌薤白半夏汤调控CHD 的主要方式与核心靶点。

2.11 分子对接使用TCMSP 数据库下载核心活性成分的3D 结构，保存为SDF 格式，使用OpenBabel软件将文件格式转换为mol2。 在PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）中检索基因靶点，物种筛选条件为“Homo sapiens”，将核心靶点的3D 结构保存为PDB 格式，使用PyMOL viewer 软件打开并去除水分子及配体。使用AutoDockTools 软件对靶点的3D结构进行加氢键处理，设置grid box 覆盖全部结构，运行Autogrid 程序进行第一次对接运算，使用Genentic Algorithm 算法进行运算后，运行AutoDock程序进行第二次对接运算。统计结合能，若结合能≤-5 kJ/mol 即可认为对接成功，将筛选出的结合位点保存为PDBQT 格式文件后，使用PyMOL viewer 软件进行可视化处理。

3 研究结果

3.1 酒煎瓜蒌薤白半夏汤化学成分分析供试液正负离子模式的总离子流色谱图（TIC）见图1。在正、负离子模式下从酒煎瓜蒌薤白半夏汤中共分析鉴定出76 个化学成分，包含正离子模式下鉴定出的59 个化学成分及负离子模式下鉴定出的17 个化学成分。

图1 酒煎瓜蒌薤白半夏汤UPLC-Q-TOF/MS 分析的TIC

3.2 药物-疾病共同作用靶点酒煎瓜蒌薤白半夏汤组成药物中瓜蒌作用靶点603 个，薤白作用靶点140 个，清半夏作用靶点623 个，去重后得到作用靶点751 个。CHD 靶点取交集，共得到靶点1 249 个。绘制韦恩图（图2），酒煎瓜蒌薤白半夏汤与CHD 的靶点取交集后获得潜在作用靶点190 个。

图2 药物-疾病作用靶点韦恩图

3.3 中药-活性成分-靶点网络构建将瓜蒌、薤白、清半夏的活性成分及作用靶点输入Cytoscape3.8.2软件后绘制网络图，190 个潜在作用靶点与所对应的52 个活性成分参与网络图绘制，见图3。潜在作用靶点相关联的活性成分中，10 个成分能与20 个以上的靶点相连接，推测这10 个成分是酒煎瓜蒌薤白半夏汤发挥CHD 治疗作用的主要活性成分，见表1。

表1 酒煎瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分信息表

图3 中药-活性成分-靶点网络图

3.4 PPI 网络及功能富集分析酒煎瓜蒌薤白半夏汤的PPI 结果显示，其中94 个核心靶点均有相互作用，300 条边构成了各蛋白之间的互作网络，见图4。其中白细胞介素（IL）-1β、 磷酸肌醇3 激酶α（PIK3CA）、雌激素受体（ESR）2 等靶蛋白关联度排名较高。GO 富集分析显示，生物过程结果主要涉及激素反应、对炎症反应的调节作用、细胞迁移的正向调控等；细胞组成结果主要集中于膜筏、膜侧等；分子功能结果主要涉及丝氨酸水解酶活性、脂质结合、血红素结合等。KEGG 功能富集分析结果主要涉及脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、cGMP-PKG 通路、钙信号通路、PPAR 信号通路，见图5。Upset 分析显示，激素反应与脂质结合的相关靶点存在高度重合，12 个共同靶点作为关键靶点，分别为雄激素受体（AR）、ESR1、ESR2、核受体亚家族1H3（NR1H3）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）、过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARD）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、血小板活化因子受体（PTAFR）、维生素D 受体（VDR）、维甲酸X 受体α（RXRA）、核受体亚家族3C1（NR3C1）、核受体亚家族3C2（NR3C2），见图6。

图4 PPI 网络图

图5 GO 与KEGG 富集分析示意图

图6 激素反应与主要细胞成分及分子功能靶点交互关系

3.5 分子对接对“3.4”筛选出的12 个关键靶点获取PDB ID 和靶点结构，再分别与有效成分进行对接。结合能≤-5 kJ/mol 表示有较好的结合活性，有效成分中环（亮氨酸-酪氨酸）、美迪紫檀素、肉叶芸香碱显示结合能力较好，与关键靶点进行了11 次成功对接，见表2。分子对接的可视化结果见图7。

表2 关键靶点与有效成分分子对接信息表

图7 分子对接示意图

4 讨论

本研究将751 个酒煎瓜蒌薤白半夏汤作用靶点与1 249 个CHD 靶点取交集，获得药物-疾病潜在作用靶点190 个。结果显示，52 个活性成分与潜在作用靶点有对应关系，通过中药-活性成分-靶点网络分析发现，美迪紫檀素、肉叶芸香碱、环（亮氨酸-酪氨酸)、亚油酸、石榴酸为酒煎瓜蒌薤白半夏汤影响CHD 疾病靶点的主要活性成分。其中，美迪紫檀素是一种具有生物活性的紫檀香酚，通常被应用于关节炎、骨质疏松等疾病的治疗[9]。炎症反应在CHD发病全程都起到重要的作用，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6 等促炎因子的上升被证实与CHD发病相关[10]。有研究发现，美迪紫檀素可通过下调各种促炎细胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-17A，上调抗炎细胞因子IL-10，发挥调节炎症细胞活性的作用[11]。肉叶芸香碱是一种具有抗癌和抗炎作用的天然生物碱。有研究指出，肉叶芸香碱通过增加一氧化氮（NO）的释放舒张血管，抑制肾上腺素受体功能与钙通道激活所导致的血管收缩[12]。而NO 和钙通道抑制剂被认为对CHD 有治疗作用[13]。环（亮氨酸-酪氨酸）是一种具有生物活性的环状二肽，有抑制血小板聚集的作用，能通过激活PI3K/Akt 通路产生抗炎作用，有效治疗CHD[14]。亚油酸是一种不饱和脂肪酸，增加亚油酸的摄入可以降低CHD 等心血管疾病导致的病死率[15]。亚油酸也具有抗氧化应激与抗炎的作用，能够调控血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，降低血清中MMP-9 水平有利于CHD 疾病转归[16]。有研究发现，石榴酸可通过激活PPARG 调控CHD 的发展[17-18]。因此，酒煎瓜蒌薤白半夏汤可能通过美迪紫檀素、肉叶芸香碱、环（亮氨酸-酪氨酸）、亚油酸、石榴酸等活性成分影响CHD 的疾病进程。

为深入挖掘酒煎瓜蒌薤白半夏汤调控CHD 的潜在作用机制，本研究进行了GO、KEGG 富集分析。有研究显示，cGMP-PKG 通路异常可引起多种心血管疾病[19]。通过激活cGMP-PKG 通路并上调LDLR基因表达，清除过多冠状动脉内皮细胞的低密度脂蛋白（LDL）可缓解内皮损伤[20]。钙通道拮抗剂可抑制血管平滑肌中的钙通道引发的血管收缩，通过扩张血管调控CHD[21]。

在本研究中，Upset 分析结果显示，激素调控与脂质结合存在关联，其中AR、ESR2、PPARA 等12 个靶点被认为是核心靶点。通过分子对接对12 个核心靶点与酒煎瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分进行分析，结果显示其中6 个核心靶点与以上3 个活性成分成功对接，包括PPARA、RXRA、AR、PPARG、PPARD、ESR2。其中，PPARG 与RXRA 属于核受体超家族，是动脉粥样硬化发病机制中的关键参与者[22]。相关研究证明，PPARG 与RXRA 在CHD 患者的巨噬细胞和平滑肌细胞中表达水平均显示出下调趋势，相关基因的低表达不利于CHD 患者的愈后[23]。PPARA、PPARG、PPARD 是脂蛋白代谢、能量平衡、炎症反应的主要调节因子，可独立或通过相互作用导致机体脂代谢异常，提高CHD 的发病风险[24]。雄激素也被证实对CHD 有调控作用，能够降低CHD易感基因ADTRP 的表达，在心血管疾病中起保护作用[25]。ESR2 可与雌激素进行高亲和力的结合，雌激素已被证明可以通过其受体ESR2 下调HUVEC 中糖蛋白（GP130）的表达，而GP130 是IL-6 转信号通路中的重要信号转导因子，在动脉粥样硬化的慢性炎症中起关键作用[26]。雌激素也可通过其G 蛋白耦联受体GPER 和SR-BI 抑制LDL 转胞吞作用，可对CHD 起到预防和早期治疗作用[27]。本研究中，美迪紫檀素、肉叶芸香碱、环（亮氨酸-酪氨酸）均与以上靶点具有良好的结合能力，验证了这3 种成分可能通过影响激素反应调节脂质结合，通过酒煎瓜蒌薤白半夏汤调控CHD 对多个信号通路发挥作用。

综上，本研究运用UPLC-Q-TOF/MS 技术对酒煎瓜蒌薤白半夏汤的活性成分进行检测，运用网络药理学与分子对接技术预测酒煎瓜蒌薤白半夏汤可能通过激素反应、调节脂质结合的方式干预CHD，为后续复方药物的基础研究和CHD 的临床治疗提供数据支持和理论保障。