基于细胞自噬的中医药治疗帕金森病的研究进展*

张敬雯 范仙灵 王楠 张子腾 杨一帆,2 贾妮,2 闫咏梅,2

(1陕西中医药大学,陕西 咸阳 712000;2陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712000)

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一类以黑质多巴胺能神经元的进行性丢失为特征的神经退行性疾病,截止目前全球PD患者的总人数已超过610万[1],已成为世界第二常见的神经系统退行性改变的疾病。越来越多的证据表明,细胞自噬受损可能在PD的发病机制中发挥关键作用。自噬是维持蛋白质稳态和清除受损细胞器的关键细胞过程,功能失调的自噬与异常蛋白质聚集体的积累和线粒体质量控制机制的损害有关,并可能导致神经变性。中医药在包括PD在内的神经系统退行性病变的治疗上经验颇丰,临床效果显著,一系列研究均显示中医药治疗可能通过干预细胞自噬的过程从而抑制PD的产生及进程。因此,本文从中药单体、中药复方、针灸等中医药治疗方法回顾目前对PD发病与自噬功能障碍的作用的科学认识,对中医药治疗PD相关细胞自噬研究进行综述,明确中医药调节自噬过程的机制,以期为PD患者提供新的治疗途径。

1 PD发病与细胞自噬

PD又名震颤麻痹,是一类以黑质多巴胺能神经元的进行性病变为特征的神经退行性疾病,主要发病机制为α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的异常聚集、氧化应激、线粒体功能障碍、重复激酶2(leucine rich repeat kinase 2,LRRK2)基因突变、神经炎症及肠道菌群的失调等导致多巴胺能神经元变性[2],然而其具体发病机制仍未阐明。细胞自噬在PD的体内和体外模型中均已被证实可防止神经变性,为临床治疗PD提供了新的思路。

自噬是一种去除多余或有缺陷的细胞成分的降解过程,通过细胞内或细胞外信号的整合启动。在生长因子剥夺或营养不足的条件下,核心自噬蛋白和微管相关蛋白 1A/1B-轻链 3 (LC3-Ⅰ)脂化形成膜结合的脂化形式(LC3-Ⅱ),吞噬膜扩张形成自噬体,待其完全成熟以后就会完全吞噬靶蛋白和细胞器并与溶酶体融合,其中蛋白酶降解内部成分,然后释放产生氨基酸和脂质,供细胞循环利用[3]。在哺乳动物细胞中,存在三种类型的自噬:巨自噬、伴侣蛋白介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和微自噬。巨自噬是自噬的主要类型,通过形成自噬体并与溶酶体融合促进降解发生;CMA是需要在特定分子伴侣如HSCP70等协助下完成的自噬过程;微自噬是经溶酶体膜直接包裹入溶酶体内,经过溶解酶水解后降解内容物。一般而言,自噬指的就是巨自噬[4]。

蛋白质聚集体在中枢神经系统大量积聚为 PD的病理特征,而α-syn是蛋白质聚集体的主要成分。α-syn水平异常会损害吞噬体与溶酶体的融合,其过度表达会导致 SNAP29(介导自噬体-溶酶体融合的关键因素)水平降低,从而损害自噬体和溶酶体之间的整合,而SNAP29共表达能够逆转α-syn诱导的自噬周转,减少神经元死亡[5]。PD中自噬途径的失调表明受损的蛋白质降解系统与LBs中α-syn和其他蛋白质的积累之间存在联系。自噬缺陷或通量阻断不仅会导致PD基因编码的蛋白质的功能失调,还会加剧α-syn和 tau聚集,形成双向致病循环。α-syn与氧化应激、细胞自噬的调节均相关,过高的氧化应激水平会导致α-syn病理性扩散出现线粒体功能障碍,而自噬可以清除α-syn。而自噬异常也影响PD患者体内氧化应激和线粒体功能。一项研究提供了PD患者大脑自噬、CMA和线粒体受损的证据,即在PD患者黑质的多巴胺能神经元中观察到自噬变性,并在超微结构下显示出线粒体被大量磷酸化 ERK 标记[3]。LRRK2基因突变是遗传性PD患者的常见病因,但无论PD患者是否存在LRRK2突变,其脑内均存在LRRK2过度激活[6]。当LRRK2蛋白的过度表达激活巨自噬,通过钙相关途径诱导自身吞噬体形成的持续增加,并增加了自噬受体p62的水平。在正常情况下,野生型LRRK2可被CMA降解,但致病性突变体以及高浓度的野生型LRRK2可通过抑制溶酶体膜上的易位复合物来阻断CMA[7]。携带GBA1突变的PD患者自噬通量也会受到干扰,影响自噬体清除导致α-syn水平升高[8]。DJ-1蛋白通过调节氧化应激等方式调节线粒体功能,研究发现DJ-1蛋白可激活自噬过程来保护多巴能神经元免受线粒体功能障碍和氧化应激的影响,若DJ-1功能丧失会直接影响细胞氧化还原状态而影响自噬通量[9]。LRRK2、GBA1、DJ-1等基因突变会引起PD患者线粒体功能障碍和自噬异常,从而影响疾病进展。

当使用自噬化学诱导剂时[10-11],在PD的体内和体外模型中均观察到激活自噬可减轻神经变性,所以自噬的上调被广泛认为是一种有前途的治疗策略。

2 细胞自噬的中医机制

气是人体构成和生命维持的物质基础,若气虚则气血津液推动无力,机体各处无法得到精微物质的滋养。此时,细胞可以通过自噬的方式溶解错误叠加的蛋白质和破损的细菌器,以供应生命所需的精微物质,进而达到阴阳平衡。颜培正等[12-13]主张,人体各个系统间的信息传输依赖于气,同时自噬通过激酶级联信号传导,展示出其所控制的生理功能,这两者在生物学角度有相似之处。广泛意义上的细胞自噬过程包含了许多气体活动的元素,同时,这些气体活动也可能会对其产生一定的影响。如果肺部主要负责调节气的正常运行,那么当其出现气虚时,就可能导致气机的紊乱,进而干扰到自噬信号的传递和表达,最后有可能引发自噬的不平衡状态。另外,脾脏和肾脏的功能异常或者体内的痰湿过盛都有可能加剧肺气虚现象。而肺气虚、肺卫功能受损以及自噬失衡等情况,都会给人类身体的防卫能力带来负面效应,使得人们更容易遭受外来病原体的入侵。

中医学认为脾为后天之本,主运化,意为脾主导身体的代谢和转化。若脾失健运,则其运化水谷精微之能力将逐渐减弱,导致脏腑机体无法获得必要的滋养[14],脾虚日久,化生痰浊且无法及时清除。采用健脾祛痰疗法可以激发细胞的自噬能力,清除体内的有害细胞器和错误的折叠蛋白,进而将痰浊和其他病理代谢产物排出体外,调整身体的偏性并恢复其自我调控能力,从而实现阴阳平衡[15-16]。由此可见,通过调节细胞自噬能力恢复机体能量代谢正常和调节中医脾胃运化功能从而恢复运化水谷精微之能力存在一定关联,故自噬缺失可以看作是脾胃功能衰退的微观基础。

人体是阴阳对立统一的整体,自噬水平失衡出现自噬不足或自噬过度的病理表现,可以类比到中医所说的阴阳失衡概念。近代中医学者研究提出3种支持观点:一是将细胞自噬这个病理生理现象看作是从微观层面上反映出人体对阴阳平衡的调整;二是细胞自噬消除有害物质并修正自身的方式被视为一个体现机体内阴阳相互协调的微观机制;三是引发细胞自噬性凋亡的过程可以理解为个体的阴阳失衡表现[17-18]。中医注重阴阳平衡,若阴阳失衡,身体内部可能出现机能失调的情况,自噬能够清除胞内废物并保持平衡和稳态,有助于修正阴阳失衡,以纠正邪盛正衰的不平衡状态,实现机体自我调整。

3 中医药调控细胞自噬对PD的作用

PD 传统治疗方案以口服左旋多巴治疗为主,但这仅能改善患者的运动症状,并不能延缓或阻止PD的病程进展,长期使用还会出现一系列不良反应及并发症,影响患者的生活质量。因此,寻求新的治疗思路至关重要。根据PD的临床具体表现可将归纳为中医学“颤证”的类别,颤证病位多责之于肝、脾、肾三脏,其病理性质当为本虚标实,多由患者年龄、思维情志等因素日久导致机体气、血、津、液亏虚,筋脉失于濡养,风气内动,或热盛动风,扰乱筋脉而发为肢体颤动,故名“颤证”[19]。临床治疗PD多从脏腑入手,治其“本虚”而“标实”则愈,根据其证型的差异而采取不同的治法,以五脏气血阴阳为核心,尽量调节全身使机体达到“阴平阳秘”,从而缓解PD的临床症状[20]。当前不少临床研究结果已显示,常规治疗结合中医药治疗方法可显著提高PD临床疗效,同时降低不良反应及副作用,常用的治疗手段有中药单体、复方、针刺等,有操作简便、有效、耐受的优点。

中医药能够通过多重通路提高自噬蛋白表达,促进细胞自噬,减少细胞凋亡,防止由黑质多巴胺能神经元变性引起的神经病变,改善PD患者临床症状,多项现代研究结果均已表明,中医药治疗PD的机制可能是通过调控细胞自噬手段来实现的,其中中药单体、复方[21-22]和针灸疗法[23]的研究最多,也较为透彻。

3.1中药单体调控细胞自噬对PD的作用 研究显示山奈酚能有效改善PD模型小鼠的运动及行为学障碍,保护小鼠多巴胺能神经元内细胞器的完整性,维持自噬小体形态,并通过调节mTOR通路中TH蛋白和Beclin-1、LC3等自噬蛋白表达,降低p62、cleaved Caspase-3凋亡相关蛋白表达,发挥对PD模型小鼠的保护作用[24]。厚朴酚(厚朴活性成分)能激活自噬上游AMPK/SIRT1通路,使得p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1上调,逆转Bcl-2/Bax比值,减少细胞凋亡,改善小鼠行为学障碍。同样,石菖蒲挥发油亦能对AKT/mTOR通路起到抑制作用,产生和厚朴酚相似的神经保护作用[25]。而姜黄素则是通过改善MPP+诱导SH-SY5Y的PD模型细胞存活率,抑制PI3K和下游Akt磷酸化,降低p-mTOR表达水平诱导自噬发生,清除α-syn从而增加多巴胺能神经元存活数,来保护PD细胞模型[26]。白藜芦醇(虎杖的有效成分)可防止 SH-SY5Y 细胞中鱼藤酮诱导的细胞凋亡,并通过自噬诱导增强表达 α-syn的 PC12 细胞系中 α-syn的降解,这种效应被 Beclin-1 敲低或溶酶体抑制所逆转,表明巨自噬对于白藜芦醇诱导的 α-syn 清除至关重要[27]。此外,乌梅干预6-OHDA诱导的PD大鼠,其LC3-Ⅱ、Beclin-1、BNIP3蛋白上调且上调水平与剂量呈正相关,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶相比模型组活力明显提高,提示乌梅通过调控线粒体自噬,发挥保护线粒体作用[28]。另外,在穿心莲相关研究中发现其有效成分穿线莲内酯既可以通过抑制NLRP3炎性小体减轻神经炎症,又可以激发脑内线粒体自噬,改善PD小鼠行为学功能[29]。牟蕾使用MPTP构建斑马鱼PD模型,黄连素衍生物9-OH小檗碱可以改善其运动迟缓等行为,与下调lc3b、atg5等基因和α-syn蛋白表达有关[30]。

因此,中药有效成分山奈酚、姜黄素、穿心莲内酯、白藜芦醇、厚朴酚、石菖蒲挥发油等可以通过激活线粒体自噬,增加Beclin-1、LC3等自噬蛋白表达,抑制神经炎症而发挥保护多巴胺神经元的作用。

3.2中药复方调控细胞自噬对PD的作用 PD的发病机制尚不明确,临床上PD患者证型不一,中药单体神经保护作用有限,而中药复方遵循中医药辨证论治原则,疗效显著。随着对细胞自噬与PD研究的不断深入,越来越多研究人员开始从细胞自噬角度探索中医药对PD的治疗机制。平肝益肾方可以促进细胞自噬,调节Beclin1、LC3B表达,抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤而保护神经元[31]。止颤汤可通过p62蛋白改善注射lactacystin制备的PD大鼠症状[32]。李茜羽等[33]发现苁蓉舒痉颗粒干预增加了自噬蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达,激活SIRT1、FoxO1、FoxO3a蛋白表达,使黑质多巴胺神经元数目增多,脑活性氧水平降低,改善PD大鼠各项行为学障碍。加味五虎追风散可通过TFEB,使得LC3Ⅱ、P62表达量降低,缓解α-syn聚集[34]。菖蒲郁金汤能通过上调LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值,减少α-syn蛋白表达,促进神经元细胞的自噬活性,并明显增加小鼠黑质TH阳性细胞表达,从而起到对PD小鼠的神经保护作用[35]。韦一佛等[36]用滋肾益髓方干预PD小鼠模型,结果显示,中药组小鼠Cath D、HSP70蛋白上调,与模型组相比有统计学意义,说明用药后增强了CMA而治疗PD。彭伟等[37]将50只大鼠分为假手术组、PD模型组、西药组、天麻钩藤饮高、低剂量组,研究显示给药8 w后大鼠黑质部Beclin1、LC3B表达强度明显增强,α-syn减少,模型大鼠的神经损伤症状减轻。高鑫等[38]采用MPP+刺激SH-SY5Y细胞制备PD模型,分为对照组、模型组、拜颤停复方组、自噬抑制剂3-MA组,研究结果显示拜颤停复方不仅可以降低Bax、Caspase等凋亡蛋白表达继而改善细胞凋亡,同时上调Bcl-2、LC3B、Beclin蛋白促进自噬,在给予3-MA后,上述改变被逆转,说明拜颤停复方通过促进神经元自噬,干预了自噬与凋亡平衡,反馈性抑制凋亡,从而实现神经保护的作用,进而治疗PD。经方敛肝熄风止颤方,能够抑制过度激活的CaMkkβ、p-AMPK蛋白,使得细胞不因过度自噬而破坏线粒体结构,其止颤效果随剂量上升而增强,表明其对PD具有神经保护作用[39]。龟羚帕安丸对6-OHDA诱导的PD大鼠模型有保护作用,表现为大鼠黑质部神经元损伤减少,Beclin1、P62、LC3Ⅱ蛋白表达较模型组明显上升[40]。

故而,中药复方能从调节自噬与凋亡间平衡、降低细胞凋亡、避免细胞过度自噬等多种角度达到改善震颤症状、减轻神经损伤的效果。

3.3针刺疗法调控细胞自噬对PD的作用 早在1996年,中国就率先开展了针刺治疗PD的动物实验研究,先前的研究显示针灸治疗在改善PD患者认知功能和生活质量方面有一定优势,同时降低了药物不良反应发生率。针刺干预PD的作用机制主要体现在增加脑内神经营养因子、减少脑内异常代谢产物、增强自噬、减少α-syn聚集、抑制神经细胞凋亡、抑制氧化应激、抑制内质网应激、调节肠道菌群及减轻神经炎症反应等方面。吴海洋等[41]采用通督调神针刺法提高线粒体自噬水平和纹状体中多巴胺含量,改善神经元形态,从而保护PD模型小鼠神经损伤。符之逸[42]电针针刺“百会、太冲”穴位治疗MPTP诱导的PD小鼠发现,电针后可上调Agt7、p62、LC3等自噬蛋白,减弱MPTP对小鼠的神经损伤,进一步减少α-syn的表达,改善PD模型小鼠运动功能障碍。罗宇雄等[43]对鱼藤酮诱导大鼠的百会、肾俞、太溪穴位每周进行1次埋线处理,5周后行为学数据显示实验组移动潜伏期缩短并有统计学意义,蛋白免疫印迹结果显示LC3 B-Ⅱ/LC3 B-Ⅰ蛋白上调,p63蛋白下调并可改善细胞凋亡,降低α-syn表达,改善了PD症状。马骏等[44]利用鱼藤酮制备PD模型,将60只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组,实验结果表明,电针 “太冲、风府”穴后,模型大鼠CMA相关Lamp2A蛋白和Hsc70蛋白表达水平上升,α-syn聚集被抑制,大鼠PD样症状得到改善。

以上实验证据表明,针刺“太冲”“百会”“肾俞”“太溪”等穴位能抑制α-syn聚集,增加自噬相关蛋白表达,实现改善运动功能障碍的目的。

4 小结

PD困扰人群众多,而发病病因及机制不明为临床治疗带来极大挑战,需要创新和整体的治疗方法。近年来随着中医学者对PD的认识逐步加深,中医药治疗已被越来越多地运用于此类疾病的临床治疗中,且临床研究显示中医药治疗PD对改善其临床症状具有显著疗效。细胞自噬是 PD 发病机制中的一个关键过程,目前各项研究显示,不论是中药单体、中药复方或针刺等各类中医药疗法应用越来越广泛,利用中医的独特视角,多种传统疗法相结合以及个体化治疗方法,通过细胞自噬干预,在溶酶体消化降解过程中清除受损细胞器和错误折叠蛋白质等来达到物质代谢所需,从而使细胞本身达到内稳态,细胞器不断更新,有望增强自噬清除率并改善PD的临床结果。自噬在PD中作用复杂,涉及氧化应激、神经炎症、细胞凋亡等多个方面,但目前研究较少,不论是中药单体、中药复方或针刺研究仍是以基础研究为主,尤其是中药单体多为体外或动物实验,无法运用于临床,因此更应着眼于中药复方的深入研究,对复方进行拆分或调整,进行标准化随机对照试验,深挖相关信号传导、作用靶点等机制研究,将基础实验与临床研究结合起来,为中医药治疗PD提供更多高质量的理论支撑和循证医学证据。未来可着眼于此进一步完善中医药基于细胞自噬的研究,包括严格的科学研究和大规模、多中心的临床试验,为PD患者的循证中医干预铺平道路。