黄芪根腐病拮抗菌的筛选及生防机制

许磊磊　白晓丽　李哲斐

摘要：由Fusarium oxysporum引起的根腐病是制約黄芪产量和品质的重要因素之一，为了获得环境适应性强且拮抗效果好的黄芪根腐病生防菌，以病原真菌F.oxysporum为指示菌，通过稀释涂布法和平板对峙实验从黄芪根和根际土壤中共分离得到197株细菌，其中20株细菌对病原真菌有拮抗作用，且20株拮抗菌中优势菌为芽孢杆菌.7株拮抗菌对病原真菌生长抑制率超过35%，用这7株细菌进行盆栽试验，结果表明，菌株AS1对黄芪根腐病的防治效果最好，在接种病原菌第20 d时AS1对黄芪根腐病的防效达46.86%.进一步研究发现，菌株AS1基因组中含有伊枯草素、脂肽和杆菌霉素的编码基因，AS1处理后病原真菌孢子萌发率下降了74.4%.接种AS1第8 h后植物的苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶活性和茉莉酸含量较不接种对照分别提高了16.0%，21.5%，10.6%，12.6%，14.2%和97.3%.此外，AS1处理15 d后使黄芪的根长和株高分别增加了37.52%和12.78%.根据生理生化特征和16S rDNA测序发现菌株AS1归属于贝莱斯芽孢杆菌.因此，AS1是一株具有较大应用潜力的生防和促生菌株.

关键词：黄芪根腐病；生防菌；诱导性系统抗性；贝莱斯芽孢杆菌

中图分类号：S 432.45 文献标志码：A文章编号：1001－988Ⅹ（2024）02－0077－09

Screening of antagonistic bacteria and biocontrol mechanism of astragalus root rot

XU Lei－lei，BAI Xiao－li，LI Zhe－fei

Abstract：Root rot caused by Fusarium oxysporum is one of the important factors restricting the yield and quality of Astragalus mongholicus.In order to obtain biocontrol bacteria with excellent environmental adaptability and antagonistic effect，a total of 197 bacterial strains were isolated from the roots and rhizosphere soil of Astragalus mongholicus via dilution coating method and plate confrontation using F.oxysporum as indicator pathogen.Twenty bacterial strains had the ability to inhibit the growth of fungal pathogenic mycelia through preliminary screening，and the dominant bacteria among the twenty strains were Bacillus.The inhibition rate of 7 antagonists to fungal mycelial growth was more than 35%，these 7 bacteria were selected to perform pot experiment.The results showed that strain AS1 had the best control effect on astragalus root rot，and the control effect was 46.86% on the 20th day after inoculation of AS1.Further studies showed that the genome of strain AS1 contained the coding genes of iturin，lipopeptide and Bacilysin.After AS1 treatment，the spore germination rate of pathogenic fungi decreased by 74.4%.The activities of phenylalanine ammonia lyase，chitinase，polyphenol oxidase，peroxidase，lipoxygenase and jasmonic acid content of plants inoculated with AS1 increased by 16.0%，21.5%，10.6%，12.6%，14.2% and 97.3%，respectively.In addition，after 15 days of AS1 treatment，the root length and plant height of astragalus increased by 37.52% and 12.78%，respectively.According to physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing，the strain was found to belong to Bacillus velezensis.Therefore，AS1 is a biocontrol and growth promoting bacterium with great application potential.

Key words：root rot;biocontrol bacteria;inducing systemic resistance;Bacillus velezensis

黄芪是我国使用非常广泛的传统中药材，为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）或膜荚黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge）的干燥根.黄芪含有黄酮类、皂苷类和多糖类等多种活性成分，具有抗菌、利尿、降压、补气固表等功能［1－3］.因其极高的应用价值和经济价值而在我国广为栽培［4］，其中山西、甘肃、内蒙古、陕西、河北等省为主要产区.由于黄芪生长需要质地疏松和渗水较好的土壤，使得黄芪种植区域受到一定限制.因此，黄芪种植过程中连作时间延长，轮作周期变长，造成了土壤中微生物群落组成发生改变［5］，细菌总数/真菌总数比例减小，最终使得黄芪在种植过程中土传病害发生率较高.其中根腐病是一种比较常见的病害，严重感染时能造成田间30%～80%的植株染病，极大的降低了黄芪的产量和品质［6－7］.引起黄芪根腐病的病原体主要包括Fusarium solani，Fusarium oxysporum，Fusarium acuminatum，Fusarium equisetim，Alternaria sp.等真菌［8－9］.这些病原真菌的孢子在土壤中以休眠体形式长期存在，防控较为困难［10］，所以如何有效的防治根腐病的发生是黄芪种植产业中亟待解决的问题.

目前对黄芪根腐病的防治主要通过使用化学杀菌剂和筛选抗性品种.然而筛选抗性品种是一项耗费时间、投资较高的手段，但抗根腐病能力较强的黄芪品系依然缺乏.化学杀菌剂是一种快速有效的黄芪根腐病防治方法，但长期使用化学农药不但造成残留在土壤中农药的积累，引起环境污染，而且农药也在植物中大量富集，使药材品质严重下降［11］.生物防治方法对环境友好，是预防作物土传病害最有前景的方法之一.目前已经从多种植物组织和根际土壤中分离得到了对病原真菌生长具有抑制作用的微生物.张爱梅等［12］从沙棘根瘤内分离的Bacillus tequilensis对黄芪根腐病有较好的防治效果.

高通量测序技术的发展揭示了在干旱、盐碱和病害胁迫下，植物能招募有益的微生物在其根际、叶际和植物组织内定殖，这些富集的微生物能帮助植物抵抗非生物和生物胁迫［13］.所以近些年来学者们开始关注从植物根际和根内分离拮抗菌并用于作物土传病害的生物防治.例如沈艳等［14］从小麦中分离的生防菌解淀粉芽孢杆菌B9601－Y2对Botrytis cinerea的生长有明显的抑制作用，在接种该生防菌后对番茄灰霉病的防治效果可达88%.闫助冰等［15］发现Bacillus velezensis在PDA平板上对Sclerotium rolfsii菌丝的生长抑制率为81.9%.盆栽试验表明该菌对花生白绢病的生防效果高达66%［15］.然而，关于黄芪根腐病生物防治方面的研究较为缺乏.

为了探究拮抗菌对黄芪根腐病的防控作用，从甘肃省宕昌县采集黄芪和土壤样品，通过稀释涂布法从样品中分离细菌，再采用平板对峙法筛选对黄芪根腐病病原真菌Fusarium oxysporum生长有拮抗作用的菌株，最后通过温室盆栽实验研究了生防菌株对黄芪根腐病的防治效果和植物诱导性抗性的激活作用，以期为黄芪根腐病的田间防治提供新的途径.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 试验所用黄芪为蒙古黄芪，种子购买于当地农户.

1.1.2 供试菌株 黄芪根腐病病原真菌（Fusarium oxysporum HQ16）分离自患病黄芪根部（植株采自甘肃省宕昌县哈达铺），菌株保存于西北农林科技大学农业与环境微生物重点实验室.

1.2 方法

1.2.1 采样地点 试验所用黄芪和土样均采自于甘肃省宕昌县哈达铺镇（N 34°16.819′，E 104°09.855′，海拔2379 m）.2019年5月，在黄芪样地中随机采挖具有根腐病症状和健康的黄芪植株各6株，采样深度为40 cm.将采集的植物样品连同根部附着的土壤装于自封袋并在袋上标记采样信息后带回实验室备用.

1.2.2 根际和根内生细菌分离 用力抖动健康或发病植株根系除去表面松散结合的土壤，用毛刷将根表面1～2 mm厚的根际土刷到无菌离心管中，称取1 g黄芪根际土溶于9 mL无菌水中充分溶解，吸取1 mL土壤悬液10倍梯度稀释至10-7，备用.然后将上一步去掉根际土的根段用75%乙醇消毒2 min，3%次氯酸钠消毒1 min，再以无菌水冲洗6次.将表面消毒的根在无菌研钵中充分研磨，吸取1 mL匀浆液并进行10倍稀释至10-7，分别取100 μL上述根际土悬液和根研磨液（10-5，10-6和10-7）以无菌操作法涂布于TSA，LB和R2A固体培养基上，于28 ℃培养3～5 d.将长出的不同特征菌落在LB培养基上纯化，所得菌株保存于4 ℃冰箱备用.

1.2.3 拮抗菌筛选 用无菌打孔器从长有F.oxysporum的PDA平板取直径5 mm的菌块，将菌块置于新的PDA平板中心，将10 μL根内生或根际细菌悬液分别接种于距离菌块中心2.5 cm处，以滴加相同体积无菌水作为对照，每个处理含3个重复，所有平板于28 ℃培养5 d.观察病原真菌生长情况，计算生长抑制率.

菌丝生长抑制率=（对照组真菌菌落半径-处理组真菌菌落半径）/对照组真菌菌落半径×100%.

1.2.4 拮抗菌株的鉴定 用细菌DNA提取试剂盒DP302（北京天根生化科技有限公司）提取所分离得到的拮抗菌株基因组DNA，以引物27F/1429R扩增各个菌株的16S rDNA（表1）.扩增体系和条件为：模板DNA 2 μL，引物27F和1429R各1 μL，2×PCR Mix 25 μL，ddH2O 21 μL，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，56 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，30循环；72 ℃延伸6 min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后剩余扩增液送上海生工测序，在NCBI网站对所得序列进行搜索，将相似度较高的16S rDNA序列下载并输入到MEGA6.06软件中.序列比对完成后选择MEGA软件菜单中“Phylogeny”－“Construct/Test Neighbor－Joining Tree”，Bootstrap Replications参数选择1000，其余为软件默认构建系统发育树.并参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》对菌株AS1的生理生化特性进行测定.

1.2.5 盆栽防效测定 将土壤、蛭石和泥炭按3∶2∶1（V/V）混合均匀后装入蘑菇种植袋，每袋600 g.将7株拮抗能力较强的菌株分别接种于LB液体培养基中，28 ℃振荡培养24 h.菌悬液8 000 r·min-1离心10 min，沉淀用无菌水洗涤后再次离心，将细胞重新溶解于无菌水中，调节OD600为0.8，取10 mL上述菌悬液接种到种植袋中.将5棵发芽2 d的黄芪种子播种于种植袋中.5 d后，在种植袋中加入10 mL病原菌孢子悬浮液（105个·mL-1）.2 d后再向种植袋中接种10 mL菌悬液.以无菌水代替菌悬液作为对照，每个处理做10袋重复，所有处理放于玻璃温室培养.期间每隔3 d统计黄芪发病株数和20 d的病情指数，同时对植物株高、根长、干重和鲜重等指标进行测定.黄芪根腐病防治效果=（（对照病情指数-菌液处理病情指数）/对照病情指数）×100%.

1.2.6 菌株AS1对真菌孢子萌发的抑制 将菌株AS1在LB培养基中培养至指数生长阶段，调整菌悬液浓度为108 CFU·mL-1.将等体积的细菌悬液和真菌孢子悬液（106孢子·mL-1）混合，以不接菌的LB培养基和孢子悬液混合作为对照，每个处理重复3次.孢子在25 ℃黑暗环境下萌发10 h，显微镜下统计同一个视野中萌发的孢子数量，计算萌发抑制率：孢子萌发抑制率=（（对照组萌发孢子数-处理组孢子萌发数）/对照组萌发孢子数）×100%.

1.2.7 菌株AS1抗菌物质编码基因检测 如1.2.4所述提取菌株DNA，参照Zhu等［16］的方法对菌株可能的抗菌物质编码基因进行扩增（表 1），PCR产物送北京擎科生物技术公司测序，在NCBI以BLASTn进行比对.

1.2.8 植物诱导性系统抗性测定 将600 g基质（土壤、蛭石和泥炭按3∶2∶1混合）装入蘑菇种植袋并种植催芽的黄芪种子.当黄芪生长1个月后将10 mL OD600为0.8的AS1菌悬液接种于黄芪根周围，以添加等量无菌水作为对照.分别于接菌后8，24，48，72，120和168 h后采集植物，分别取1 g接种AS1和无菌水的黄芪根（每个处理3个重复），加入2 mL 0.1 mol·L-1PBS缓冲液置于冰上研磨.匀浆液在14 000 r·min-1条件下离心20 min，根据试剂盒说明书取上清液对苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、几丁质酶（chitinase）酶活性和茉莉酸（JA）含量进行测定.

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0和EXCEL 2013软件对所得数据进行分析和处理.

2 结果与讨论

2.1 拮抗菌株筛选

从黄芪根际和根共分离得到197株细菌，其中发病根中分离到104株，健康根中得到44株，发病植物根际土8株，健康根根际土41株.平板对峙试验结果表明，有20株细菌对F.oxysporum菌丝的生长有明显的抑制作用，占所有分离菌株的10.2%.进一步统计发现，从患病植物根和根际中分离得到拮抗菌株9株，从健康植物根和根际分离到拮抗菌株11株.此外，20株拮抗菌分别属于芽孢杆菌属、不动杆菌属和假单胞菌属等13个属，其中芽孢杆菌为优势属（7株）.这可能是芽孢杆菌属细菌在不良环境中形成孢子，从而对干燥、辐射和渗透压具有比较强的抵抗能力.例如枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等都被研制成生防菌剂并用于田间作物防病［17－18］.胡党振等［19］发现复合芽孢杆菌灌根处理能‘沃柑根褐变减少、黄龙病的发病率降低约50%.

通过对这20株拮抗菌的真菌菌丝抑制率计算发现，编号为AS1，AS11，AS51，AS56，AS5，AS42和AS87的7株菌抑菌效率较高，每株菌的平均抑制率均超过35%（表2），故后续选择这7株拮抗菌进行下一步试验.

2.2 拮抗菌对黄芪根腐病发病率的影响

通过盆栽试验评价了上述7株拮抗菌对黄芪根腐病的防治效果，结果列于表3.菌株AS11，AS56和无菌水处理植物在接种病原真菌孢子第5 d后开始出现发病症状.从接种病原菌第10 d开始，所有处理组都有植物出现发病症状，但AS1和AS42处理组的发病率明显低于其他组.随着培养时间的延长，AS1处理组植物的发病率基本无太大变化并且发病率保持在较低水平，AS42处理组植物的发病率开始逐渐增加，但低于除AS1之外的其他处理组.本研究中，虽然菌株AS1对病原真菌菌丝生长的抑制效率低于AS56和AS11，但盆栽试验条件下，AS1处理黄芪在生长20 d后的发病率和死亡率分别比对照降低了34.4%和59.06%，其防病效果明显高于AS11和AS56.这可能是由于AS1属于贝莱斯芽孢杆菌，其在土壤中的生存能力要优于其他属的菌株，所以AS1能更好的在黄芪根际或根内定殖，进而发挥防病功能.

同时，从试验结果发现AS1处理后大部分植物根部颜色呈白色，没有发现病斑，地上部分直立.空白对照组的大部分植物根部出现褐色病斑，根茎结合出长出大量白色菌丝，植物叶片枯萎，茎开始倒伏（图1）.近年来，由一些病原真菌引起的作物土传病害在世界范围内造成了重大的经济损失［20］.而黄芪是我国一种重要的传统中草药，在长期的栽培过程中根腐病发病率较高.从植物根际分离有益微生物，用这些微生物制剂替代化學杀菌剂防治植物病害是作物病害防治的热点［21］.张妞等［22］从34株细菌中筛选出9株枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，对马铃薯腐烂茎线虫病有较好的生防效果.许乐等［23］发现丹参内生细菌DS－R5的发酵提取物对腐皮镰刀菌孢子萌发和菌丝生长有明显抑制作用.然而，要想在田间取得理想的防治效果，需要拮抗菌能够在植物根际或植物组织内定殖.所以研究者大都倾向于从根、茎、叶和种子中分离拮抗菌［24－25］.也有学者分离了针对黄芪根腐病的拮抗细菌和放线菌［26－27］，但在这些研究中只测定了菌株或发酵液对病原真菌菌丝生长的抑制作用，没有开展盆栽试验，所以这些拮抗菌株在实际中的效果并不清楚.本研究从黄芪根际和根内筛选的拮抗菌能更好的在根际繁殖并起到较好的生防效果.

2.3 拮抗菌对黄芪根腐病发病的盆栽防治效果

由于只有AS1能显著降低植物的发病率，因此文中计算了温室盆栽条件下该株菌对黄芪根腐病的防治效果.由表4可以看出，植物接种病原真菌孢子20 d后，AS1能很好的保护植物，其盆栽防效可达46.86%

2.4 菌株AS1对植物的促生作用

既然拮抗菌AS1能有效防治黄芪根腐病，本文研究也检测了这株菌是否具有植物促生能力.

如图2所示，接种AS1能显著增加植株的根长和根高，与未接菌的对照相比，AS1处理植株根长和根高分别增加了37.52%和12.78%.虽然接种AS1植株的鲜重和干重与对照无显著差异，但接菌处理依然高于对照.

2.5 菌株AS1的鉴定

菌株AS1在TSA培养基的上单菌落呈现乳白色，表面粗糙，不透明，边缘不规则，以膜状附着在培养基表面.在光学显微镜下观察发现该菌体形态呈杆状，革兰氏染色呈阳性（图3a，b）.能以淀粉、柠檬酸为碳源生长，甲基红试验和接触酶试验呈阳性（表5）.对菌株的16S rDNA序列进行比对并构建系统发育树，发现菌株AS1与Bacillus velezensis CR502更接近，其相似性为99.71%（图3c）.因此，文中将菌株AS1命名为Bacillus velezenssi AS1.

2.6 菌株AS1的防病机制

2.6.1 菌株AS1对病原真菌孢子萌发的抑制 如图4所示，将拮抗菌AS1与病原真菌孢子在25 ℃的黑暗条件下共培养10 h，不加拮抗菌对照组的大部分孢子开始萌发，然而AS1处理组种只有少量真菌孢子有萌发.和对照相比，AS1处理后的真菌孢子萌发率下降了74.4%，并且拮抗菌处理组的真菌菌丝明显要短于对照组.

2.6.2 菌株AS1抗菌物质编码基因 由于芽孢杆菌属中的许多菌株都能产生抗生素，因此通过PCR对菌株AS1中一些抗菌物质合成相关的编码基因进行检测.试验结果发现有3对引物（ituA F/R，srfA F/R和bacA F/R）能够从AS1基因组中扩增出DNA片段.经序列比对，这3个DNA片段分别为伊枯草素、脂肽和杆菌霉素的编码基因，这些抗真菌代谢产物可以与病原真菌相互作用，导致菌丝形态异常和破坏［28］.

2.6.3 菌株AS1对植物系统抗性的诱导

探究了AS1能否可以诱导植物系统抗性以阻止病原菌入侵.从图5可以看出，在F.oxysporum的侵染下，植物JA含量、PPO和几丁质酶活性逐渐增加，PAL，POD和LOX酶活性先升高后降低，在接种病原菌72 h后恢复上升，在168 h达到最大值.与未接种生防菌的对照植株相比，接种AS1植株的酶活性和JA含量在整个采样时间段内均显著高于对照植株.这说明在F.oxysporum侵染初期，AS1提高植物JA含量以及PAL，PPO，SOD，LOX和POD酶活性，大大增强了植株对病原真菌的抗性［29］.并且菌株AS1还提高了几丁质酶活性，而几丁质酶通过降解病原真菌细胞壁而使其裂解死亡［30］.这也可能是菌株AS1在PDA平板上抗真菌能力较弱，但在盆栽试验中其防治效果较好的一个原因.

3 结论

通过平板对峙实验从黄芪根际和根内筛选到20株拮抗细菌，其中芽孢杆菌为优势属.贝莱斯芽孢杆菌AS1在PDA培养基上对病原真菌的抑制率只有36.84%，但在盆栽实验中其防病效果却明显高于其他菌株.贝莱斯芽孢杆菌AS1基因组中包含编码伊枯草素、脂肽和杆菌霉素的合成基因.此外，贝莱斯芽孢杆菌AS1还能激活黄芪的诱导性抗性来增强植物对病原真菌的抵抗能力.

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（责任编辑 陆泉芳）

收稿日期：2023－11－05;修改稿收到日期：2024－01－22

基金项目：国家自然科学基金资助项目（42277317）;陕西省重大科技专项（2020zdzx－03－02－01）

作者简介：许磊磊（1999—），男，安徽淮南人，硕士研究生.主要研究方向为微生物资源利用.E－mail：2188209141@qq.com

*通讯联系人，教授.主要研究方向为微生物资源利用.E－mail：lizhefei@nwafu.edu.cn