软骨细胞外基质基因调控与遗传缺陷研究新进展

金渝瑜综述 罗飞宏审校

复旦大学附属儿科医院内分泌遗传代谢科（上海 201102）

软骨的生长与发育是人类生长最关键的过程，软骨形成、软骨内骨化成骨以及环境稳态的维持与长骨的发育相关。生长板骨骺软骨细胞的增殖与分化在其中起重要作用。生长板软骨细胞的增殖分化是一个精密、复杂的生物学过程，受到旁分泌因子、内分泌因子、转录因子、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、蛋白多糖以及多种信号通路的共同调控。ECM 作为确保软骨正确发育的支架，为细胞间和/或因子间的交互作用提供支撑，定向调节软骨细胞分化。编码ECM 和参与ECM 修饰的基因变异均会影响ECM 的组成与结构，导致骨骼发育异常，但病因机制复杂，导致的病变临床往往识别困难。本文就软骨细胞ECM 核心组分如聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、胶原蛋白（collagen）、软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、基质蛋白3（matrilin-3，MATN3）、潜在的转化生长因子β结合蛋白2（latent TGF-beta-binding protein 2，LTBP2）、纤连蛋白1（fibronectin-1，FN1）及原纤维蛋白1（fibrillin 1，FBN1）对骨骼发育的影响作一介绍，为临床中骨骼发育遗传缺陷性疾病的诊断与治疗提供参考。

1 聚集蛋白聚糖

Aggrecan由ACAN基因编码，是软骨ECM中最丰富的成分之一，维持软骨正常功能及生长发育。Aggrecan 的核心区域是G 1-G 3 结构域，介导ECM间的相互作用；其中G 1 结构域负责Aggrecan 与透明质酸和连接蛋白的相互作用，C 型凝集素重复域调节G 3 结构域与腱鞘蛋白和纤维蛋白的结合；ACAN可变数串联重复域编码硫酸软骨素链附着域，决定Aggrecan核心蛋白的长度[1]。携带负电荷的硫酸角蛋白与硫酸软骨素链，形成对离子和水的亲和力，为软骨提供水凝胶结构，为关节软骨提供抗压缩力等保护。Aggrecan还可通过与转录因子的相互作用，如转化生长因子（TGF）β与矮小同源盒基因等，影响基质的合成与分解[2]。

结构变异的Aggrecan通过改变亲疏水性，形成额外氢键，破坏蛋白相互作用，破坏结构域的稳定性与配体结合特性。编码硫酸软骨素链的变异，可影响蛋白硫酸化与聚集透明质酸的能力，改变基质电荷，影响软骨高机械负荷能力。G3结构域的变异，损害FBN1、FBN2与肌腱素的相互作用[3]。此外，ACAN基因变异还可与其他ECM 编码基因如COL 1 A 1基因的致病性变异形成累积损害效应[4]。结构改变或剂量不足的Aggrecan可损害软骨承重、抗压缩力等正常生理功能，导致骨软骨病变与骨骼发育异常；还可导致肥大软骨细胞提前成熟，血管和成骨细胞侵袭生长板的时间提前与程度增加，并影响骨生长相关的信号通路，进而影响生长板软骨的发育[5]。

ACAN的致病性变异导致骨骼异常发育，具有广泛性且高度可变性的临床特征，与骨龄超前的身材矮小、形态发育异常（面部发育不全、短指、宽大脚趾、脊柱前凸）、软骨发育不良、早发性骨关节炎、剥脱性骨软骨炎、早发性多发性椎间盘突出症、脊椎骨骺发育不良（Kimberley型）以及脊柱-表皮-干骺端发育不良相关，其中以特发性身材矮小最为常见。多数ACAN变异位于G 1、G 3 结构域与可变数串联重复域。不同致病表型与变异位点、类型以及外显率相关。34.33%的ACAN变异与骨龄超前的矮身材相关，截短突变表现为更严重的生长受损；可变数串联重复域多态性与腰椎间盘变性相关[6]；G3结构域的错义突变，可导致剥脱性骨软骨炎或更严重的骨骼发育不良[3]；ACAN5’端的突变可与非综合征性矮小相关，其中核心蛋白基因的常染色体隐性变异在小鼠及小鸡模型中会导致严重的软骨营养不良及围产期致死[7]。

目前针对ACAN致病性变异导致的身材矮小，可用生长激素（growth hormone，GH）治疗，GH可逆转因ACAN下调所造成的软骨细胞增殖抑制[8]，患者治疗前后的生长速度与身高差值有显著差异，且10 岁前开始GH 治疗对身高的获益更显著，未发现GH导致骨骼成熟加速与不良反应的发生，青春发育起始儿童联合促性腺激素释放激素类似物治疗可改善患者的终身高[9]。

2 胶原蛋白

胶原蛋白（Ⅰ、Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ）是软骨ECM的重要组成部分，在软骨发育过程中参与结缔组织结构形成、软骨细胞定向分化与ECM的形成。

Ⅰ型胶原蛋白由α 1 链（COL 1 A 1）、α 2 链（COL1A2）及三螺旋结构等组成，参与晚期肥厚软骨细胞在原发性海绵骨向小梁骨的转化。三螺旋结构是核心域，参与形成结缔组织。致病性变异导致位于三螺旋结构域中的核心组分甘氨酸被其余氨基酸取代，螺旋结构遭到破坏，导致Ⅰ型胶原蛋白出现结构异常。异常的基因剪接位点突变，导致无法去除内含子或必要的外显子，引起Ⅰ型胶原链异常[10]。功能异常的Ⅰ型胶原蛋白抑制肥厚软骨细胞在成骨过程中的过渡。因变异导致的错误折叠的胶原蛋白在内质网异常蓄积，激活内质网应激，造成细胞凋亡或增殖障碍，从而影响软骨发育。COL 1 A 1和COL1A2变异还通过诱发骨折和骨畸形影响骨的纵向生长[11]。除了影响骨骼的发育，COL 1A 2的纯合致病变异可通过影响线粒体功能和代谢，损害肌肉活动，导致肌无力与活动减弱[12]。

Ⅰ型胶原蛋白致病性变异可导致成骨不全症、Caffey病、Ehlers-Danlos 综合征等；上述疾病存在骨骼发育异常的共性，以及不同程度骨外组织受累等异质性。成骨不全症的特点是骨脆性和骨畸形，伴复发性骨折、身材矮小、蓝巩膜、牙本质发育不全、进行性耳聋；Caffey 病核心表现为大量的骨膜下新生骨的形成，常与儿童发热、关节肿胀疼痛相关，增加成年后身材矮小、骨折畸形、关节松弛等风险[13]。Ehlers-Danlos 综合征的经典三联征是关节高活动性、皮肤过伸性和软组织/血管脆性，伴或不伴心脏瓣膜及动脉异常。三螺旋结构中Gly-X-Y重复序列的单等位基因变异是成骨不全的最常见原因，与更低的掌骨长度相关[11]。COL1A1的双等位基因变异可能是致命的，在围产期可能造成致死性事件，但COL1A2的纯合突变大多是非致命的[14]。

Ⅱ型胶原蛋白（COL 2 A 1）是一种同源三聚体，参与维持结缔组织的结构，如透明软骨及椎间盘。三螺旋结构也是Ⅱ型胶原蛋白的核心结构之一，基因变异所导致的α 1 链的三螺旋域中氨基酸替换，可减缓蛋白质折叠成三螺旋结构的速度，影响胶原蛋白在细胞内的运输，引起过度蛋白质翻译后修饰，破坏软骨的正常发育[15]。COL 2 A 1的变异常导致Stickler 综合征、先天性脊柱骨骺发育不良、脊椎干骺端发育不良（角状骨折型）等。它们以骨骼、关节异常发育与损害为共同特征，出现身材矮小、区域骨（椎骨和耻骨）骨化异常，部分伴有进行性眼部及听力发育障碍。致病性变异所致的位于三螺旋区域的氨基酸变化与表型严重程度相关，其中甘氨酸被丝氨酸替代的临床表型高度可变，较轻或严重的表型均存在；而甘氨酸被非丝氨酸的替代仅导致轻度骨骼异常表型[16]。

Ⅹ型胶原蛋白（COL 10 A 1）由3 条Ⅹ型胶原蛋白α 1 链组成，在胎儿软骨形成和软骨内骨化过程中发挥重要作用[17]。Ⅹ型胶原蛋白疏水域和同源三聚体的变异，可通过破坏α 1 链间或α 1 链与其他分子间的相互作用，影响软骨细胞的发育。COL10A1致病性变异通过诱发错误折叠、三聚体化不全、mRNA水平的降解、异常蛋白胞内聚集，形成非功能性聚合物，引发内质网应激与单倍体不足而致病[17]。COL10A1变异可导致Schmid型骺软骨发育不良症，临床特征为进行性身材矮小伴长骨畸形（如膝内翻、膝外翻）与蹒跚步态，不伴有骨外损害。影像学表现为管状骨干骺端呈现“张开状、扩口状、增宽状以及杯状”[18]。多数与Schmid型骺软骨发育不良症相关的变异集中于Ⅹ型胶原蛋白C端非胶原性1区三聚化结构域，导致异常蛋白折叠。

Ⅸ型胶原蛋白由α1（COL9A1）、α2（COL9A2）及α3（COL9A3）链组成，是一种纤维胶原蛋白，可维持胶原纤维的完整性。剪接供体或受体位点的突变，会跳过外显子，造成α3链COL3结构域中氨基酸的框内缺失，破坏Ⅸ型胶原蛋白与其余ECM成分的相互作用。此外，mRNA 衰变或三聚化结构域的缺失会导致Ⅸ型胶原的完全缺失。Ⅸ型胶原蛋白的变异会造成多发性骨骺发育不良、Stickler发育不良（4型、5型、6型）。多发性骨骺发育不良以轻度身材矮小与早发性骨关节炎为表型特征，关节疼痛肿胀相关症状多出现在运动后[19]。

内质网应激是胶原蛋白结构异常引起致病的共同机制之一，靶向清除内质网中过度累积的异常蛋白是潜在的治疗途径。4-苯基丁酸可强化清除内质网中的异常蛋白质；从应用4-苯基丁酸的成骨不全患者中分离成纤维细胞，可观察到内质网应激减少以及肥厚软骨细胞的定向分化改善，增强骨骼的纵向生长[20]。因胶原基因变异导致的身材矮小，研究发现促性腺激素释放激素类似物与GH 联合治疗有一定疗效[21]。

3 软骨寡聚基质蛋白

COMP 是血小板反应蛋白家族的成员，表达于软骨、肌肉及真皮等组织，包含Ⅱ型表皮生长因子样重复序列、3 型钙调蛋白样重复序列和球状的羧基末端结构域等。羧基末端结构域与ECM其他分子如Ⅰ/Ⅱ/Ⅸ型胶原蛋白、Aggrecan 和FN 1 等结合，共同维持软骨结构的完整性。COMP 的3 型钙调蛋白样重复序列与羧基末端结构域富含钙结合位点，在蛋白质折叠中起重要作用[22]。3 型钙调蛋白样重复序列高比例的特定残基，如天冬氨酸、甘氨酸和半胱氨酸，可促进蛋白质折叠和钙结合[22]。COMP 与胶原蛋白、纤维蛋白、基质金属蛋白酶等ECM 以及与影响软骨细胞活性（黏附、迁移和信号转导）的表面蛋白以及生长因子相互作用，稳定ECM的结构[23]。此外，COMP还可通过与颗粒/上皮细胞前体的结合刺激软骨细胞增殖[22]。

COMP基因致病性变异导致异常的钙结合，与COMP 错误折叠相关，引起内质网异常蓄积变异体并诱发应激，诱导细胞增殖减少与细胞凋亡增加，产生软骨细胞毒性作用，影响骨骼、肌腱与韧带的发育与抗炎作用，发生炎症性损害[24]。部分致病性变异影响细胞内环境稳态，诱导钙释放，间接导致结合钙数量减少，影响蛋白质的折叠；此外，钙结合位点配位碱基的突变也会扰乱3型钙调蛋白样重复序列[25]。COMP致病性变异导致软骨细胞发育异常，影响细胞的正常排列，损害关节的承重与抗负荷能力，使其无法承受常规的力学负荷，下肢骨表现尤为显著[26]。异常的COMP影响胶原纤维的组装，导致结构松散以及稳定性降低，引起关节软骨机械强度降低和关节损害。

COMP基因致病性变异会导致身材矮小、假性软骨发育不全、多发性骨骺发育不良、家族性腕管综合征和早发性骨关节炎，可能出现脊柱四肢发育异常、异常步态、关节疼痛肿胀、肢体麻木等表现。其中假性软骨发育不全影像学多表现为长骨缩短、干骺端增大且不规则、股骨骨骺小伴扁平。骨骼发育异常的程度存在异质性。多数变异位于9～14号外显子，编码3型钙调蛋白样重复序列，直接损害蛋白质折叠和钙结合。抗炎与抗氧化可缓解因COMP变异导致的细胞内蛋白异常蓄积和应激带来的生长板软骨细胞发育损害，可作为一种治疗思路[23]。

4 基质蛋白3

MATN 3 是寡聚体ECM 蛋白家族成员，包含血管性血友病因子A 结构域、表皮生长因子样重复结构域等，在软骨和骨组织中强烈表达。MATN3具有一定的软骨保护性质，通过与ECM 的高亲和力结合，如COMP、COL2A、COL9A，维持ECM与发育的稳态[27]。此外，它还通过调节与软骨细胞稳态相关的代谢基因与细胞因子，来影响对软骨的保护作用，例如诱导白细胞介素（IL）-1 受体拮抗剂、刺激COL2A1与Aggrecan的表达、下调与骨关节炎相关基质降解蛋白酶的表达等，从而调控软骨稳态[28]。

多数MATN 3变异影响血管性血友病因子A 结构域中β折叠内的保守残基[29]。变异的血管性血友病因子A结构域与内质网蛋白p72形成稳定的复合物，阻断链内二硫键形成，促进异常链间二硫键的形成，从而发生异常折叠，产生异常二聚体与三聚体。区别于部分α螺旋的变异，β折叠类型的变异可能通过影响蛋白折叠与运输，引发内质网应激[30]。不同类型的变异所产生的表型异常程度具有差异性，MATN 3致病性变异可导致部分类型的多发性骨骺发育不良，在临床上表现为不同程度的骨骼发育不良，儿童期以身材矮小、大关节僵硬和疼痛为特征，成年后常发展为早发性骨关节炎；血管性血友病因子结构域中的错义和缺失突变可导致中至重度的多发性骨骺发育不良；表皮生长因子样结构域的变异可能与手骨关节炎的发生相关[29]。

5 潜在的转化生长因子β结合蛋白2

LTBP 2 是LTBP 家族中最大的成员，在弹性纤维结构组装中起重要作用。LTBP 2 的C 端与FBN 1的N端特异性结合，负责弹性纤维结构的组装。此外，LTBP2与TGFβ家族相互作用，通过影响TGFβ活性，调节微原纤维生成与储存[31]。表皮生长因子样钙结合域中钙结合序列变异可能会影响LTBP 2 的结构稳定性，导致ECM 中微纤维结构的破坏[32]。LTBP2致病性变异可导致Weill-Marchesani综合征3、原发性先天性青光眼、马凡样综合征或类马凡样综合征等，具有不同程度的眼部损害、骨骼发育损害、心脏损害等表型，其中骨骼发育损害体现在身材矮小，短指，关节运动受限、步态异常等[33]。

6 纤连蛋白1

FN 1 作为ECM 组装的调节因子，负责细胞和ECM 组分间的联系。FN 1 以二聚体的形式分泌，通过细胞表面整合素受体组装成原纤维聚合物。N 端装配结构域促进FN彼此间的相互作用，促进纤维的组装，形成纤维网络，影响细胞的发育与ECM 和生长因子的稳定，有助于加强骨强度和骨折抵抗力[34]。FN1也可以通过激活TGFβ/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路，刺激Y 染色体上性别决定区盒子9与COL 2 A 1的表达，显著促进软骨细胞增殖分化；通过整合素α 5 β 1 依赖性途径激活软骨再生。此外，FN1可通过激活成骨细胞的Wnt/β-连环蛋白途径来促进成骨细胞的分化和矿化[35]。FN1的异常降解或抑制，通过激活胱天蛋白酶3途径，诱导软骨细胞凋亡，增强软骨损伤。FN 1致病性变异导致FN 1组装与分泌水平功能缺陷，在囊泡中过度积累。位于N 端的变异影响FN 的形成过程，扰乱胶原蛋白组装，导致骨骼发育不良[34]。在骨骼发育异常疾病中，FN1变异可导致脊椎干骺端发育不良（角状骨折型），临床表现为多个椎体改变而导致脊柱、躯干发育异常及干骺端骨折样改变，干骺端异常主要发生在胫骨、桡骨、股骨远端，股骨及肱骨近端，在儿童生长期显著，但在生长停止时消失。影像学核心特征是与骨折改变相似的片状、三角形或曲线状的骨化中心，并位于不规则干骺端的边缘[36]。

7 原纤维蛋白1

FBN1为钙结合微纤维糖蛋白，为结缔组织提供长期的受力支撑，由表皮生长因子样结构域、表皮生长因子样钙结合域、TGF-β结合（TGF-beta binding，TB）域等组成。FBN 1在生长板ECM 中尤其在静止区和增殖区含量丰富。FBN 1 已被证明可通过改变TGF-β 或骨形态发生蛋白的储存与局部活性来调节其生物利用率，参与线性骨生长的调控[37]。此外，FBN1对于微纤维的形成和调节至关重要。FBN1可与COL16A1、整合素α5/β3、LTBP2等发生交互，促进原纤维的形成。TB 5 结构域的变异通过影响蛋白结合位点与肝素的相互作用，影响细胞黏附。其中，TB 5 结构域的截短中断导致微纤维功能障碍。此外，TB5结构域变异可扰乱TB4与TB5形成的微环境，损害整合素与TB4的结合，影响纤维的形成[38]。FBN1变异导致肢端发育不良、geleophysic发育不良和Weill-Marchesani综合征，它们具有相似的临床特征，均以骨骼异常发育为主要表型，表现为身材矮小、关节僵硬、步态异常、皮肤增厚、面部异常、智力正常等，伴或不伴有心脏瓣膜发育、眼部发育异常[39]。有研究报道，在秘鲁地区阳性选择的FBN 1错义突变是当地身高偏矮的遗传性原因之一[40]。导致Weill-Marchesani 综合征的FBN 1变异多数集中于13、15、24～28、32和43号外显子，导致肢端发育不良的变异主要位于41 和42 号外显子的热点突变区域[37]。表皮生长因子样结构域的变异主要导致马凡综合征或马凡样综合征，其特征是高大身材、骨骼和眼部异常及心血管系统受累。

综上，ECM 对生长板软骨细胞的发育、支持与成熟具有关键作用。不同ECM 组分共同实现软骨发育的精密调控。异常的ECM以不同的机制损害细胞组织的生长发育，从而对骨骼发育形态造成损害。基于ECM变异导致骨骼发育异常的机制，在分子水平开发潜在的治疗手段可能改善因ECM 变异导致的骨骼发育遗传缺陷。