液相色谱-串联质谱法测定茶叶及其制品中游离氨基酸的研究进展

◎ 吴 丹，苏 敏，吴彦蕾，周纯洁

（重庆市食品药品检验检测研究院 国家市场监管重点实验室（调味品监管技术），重庆 401121）

茶叶及代用茶是人们餐桌上的重要饮品，最初以药用为主，后因其特有的风味特征带来的适宜口感，且含有生物活性物质，具有保健功能，被广泛应用于日常饮食中[1-2]。茶叶及代用茶特有的香气、滋味、生物活性与其游离氨基酸组成和含量密切相关[3-4]。氨基酸普遍具有很强的极性，且无紫外或荧光信号，因此需衍生化后再进行测定，主要检测方法有分光光度法、气相色谱法、液相色谱（Liquid Chromatography，LC）法及毛细管电泳法等[5-6]。衍生化技术虽然可以解决色谱分离度和检测器的限制，但衍生化预处理操作复杂，容易出现衍生不完全、杂质干扰大、重现性差等问题，且现有的衍生化试剂适用范围较窄、毒性较大。因此，近年来科研工作者将游离氨基酸检测的重点集中在非衍生化直接检测方面。

液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技术结合了LC 强大的分离能力和串联质谱（Mass Spectrometry，MS/MS）的高选择性、高灵敏度、高准确性等优势，可直接测定食品中的游离氨基酸，已成为非衍生化氨基酸的理想分析手段[7-8]。本文对近年来LC-MS/MS 技术在直接检测茶叶及代用茶中非衍生化的游离氨基酸组成及含量方面的应用进展进行了综述，旨在为游离氨基酸检测方法的开发和研究提供理论参考。

1 LC-MS/MS 概述

1.1 LC 技术

LC 以液体为流动相，通过装有固定相的色谱柱分离各成分后，进入检测器进行检测[9]。反相色谱法是LC 中应用最广泛的一种分离方法，利用各成分在非极性固定相和极性更强的流动相中溶解、分配、吸附等相互作用的差异实现分离。氨基酸普遍具有很强的极性，若不经过衍生化预处理直接测定，难以在反相色谱柱上获得理想的保留效果和分离度。亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC）是一类新型色谱分离技术，采用极性固定相和水-水溶性有机溶剂为流动相，可为强极性和离子型化合物提供理想的保留效果和分离选择性，在非衍生化氨基酸检测领域受到了广泛关注[10]。

1.2 MS/MS 技术

质谱技术是一种测量离子质荷比的分析技术，常用的质量分析器有低分辨的四极杆质谱和线性离子阱质谱，以及高分辨的飞行时间质谱和静电场轨道阱质谱[11-12]。四极杆质谱具有优良的离子过滤能力，将其串联或与其他质量分析器串联，可有效提高分析的灵敏度和准确性，因此常用的MS/MS 均以四极杆质谱作为第一级质量分析器。三重四极杆串联质谱和四极杆串联线性离子阱质谱是目前应用最广泛的一类低分辨MS/MS，通过其特有的多反应监测模式扫描离子对，可有效降低背景噪音的干扰，在复杂基质中痕量物质定量分析方面具有显著优势。与三重四极杆串联质谱相比，四极杆串联线性离子阱质谱具有离子储存能力，可获得多级质谱碎片离子信息，定性能力更强。四极杆串联飞行时间质谱和四极杆串联静电场轨道阱质谱均属于高分辨MS/MS，具有更快的扫描速度和更高的质量分辨率，在非靶向的未知物鉴定和高通量筛查方面更具优势。

2 在游离氨基酸检测中的应用

2.1 茶叶

茶叶中的氨基酸种类丰富，目前已发现的有20 多种，其中游离氨基酸总含量占茶叶干重的1%～4%，是决定茶叶品质的重要因素[13-14]。茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸，占茶叶中游离氨基酸总量的50%左右，具有降血压、抗疲劳、增强记忆力的功效，是茶叶鲜爽滋味的主要来源[15-16]。杜颖颖等[17]采用ACE EXCEL 2U AQ 色谱柱建立了茶叶中20 种氨基酸的LC-QqQ 检测方法，实际样品分析结果显示黄化品种绿茶（九凝飞黄）中茶氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和丝氨酸的含量明显高于白茶（白牡丹）和红茶（英德红茶），游离氨基酸总量为九凝飞黄＞白牡丹＞英德红茶。戴明等[18]采用LC-QqQ建立了铁观音茶中21 种游离氨基酸的检测方法，对比了21 种氨基酸在HILIC 模式的BEH HILIC、BEH AMIDE、CAPCELL PAK CR 1 ∶4 ST 色谱柱上的分离效果，发现CAPCELL PAK CR 1 ∶4 ST 色谱柱分离效果最好，选取的8 个安溪铁观音茶样品检测结果表明，茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸为铁观音中主要氨基酸，其中茶氨酸占游离氨基酸总量的40%～60%。李东芹等[19]采用LC-Q-Trap 建立了茶叶中18 种游离氨基酸的检测方法，通过反相Shim-pack VP-ODS 色谱柱进行梯度洗脱分离，标准加入法定量，对福鼎大白茶、浙农117、迎霜3个茶树品种的一芽一叶、第二叶、老叶3 个部位样品的检测结果表明，一芽一叶内氨基酸含量最高。王忠合等[20]采用高分辨的LC-Q-TOF技术建立了单丛乌龙茶中22 种氨基酸的直接测定方法，对比了SB-C18柱、EC-C18柱、HILIC-Z 柱对22 种氨基酸的分离效果，发现HILIC-Z 柱对22 种氨基酸的分离效果优于其他2 种反相色谱柱，对5 种单丛乌龙茶中游离氨基酸分析结果表明，单丛乌龙茶中茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸及天冬氨酸含量较高。刘艺静等[21]采用高分辨的LC-Q-Orbitrap技术，基于OTCML 中药成分高分辨质谱数据库和m/zCloud、Pub Chem、Chem Spider 在线数据库，在白茶和普洱生茶中分别鉴定出7 种和9 种氨基酸。

2.2 代用茶

代用茶是一种茶叶替代品，又名花草茶，是指采用除茶以外的可用于食品的植物的叶、花、果（实）及根茎等为原料加工制作的，采用类似茶叶冲泡（浸泡）方式供人们饮用的产品[1,22]。我国代用茶品种已有100 多种，由于代用茶本身具有一些保健功能，年轻的消费者逐渐增多，成为茶叶制品中一类新增长的消费产品。孙慧娟等[23]采用HILIC 模式的XBridge Amide 色谱柱建立了薄荷中21 种氨基酸的LC-QqQ检测方法，通过主成分分析和优劣解距离法对3 个不同产地样品进行综合评价，结果显示亳州产薄荷的氨基酸总量最高，阜阳次之，商丘最低，其中谷氨酸平均含量最高，脯氨酸最低。王从成等[24]采用HILIC模式的BEH Amide 色谱柱建立了玫瑰花中20 种氨基酸的LC-QqQ 检测方法，对7 个产地50 批次玫瑰花进行分析，数据显示玫瑰花中谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及丝氨酸等含量较高，四川双流和河北围场的玫瑰花品质较好。赵珊等[25]采用BEH HILIC 色谱柱建立了代用茶茶汤中21 种游离氨基酸的LC-QqQ 检测方法，选取的18 种代用茶中共检出18 种游离氨基酸，以精氨酸、天冬酰胺、脯氨酸为主，以玫瑰花中游离氨基酸总量最高。

3 结语

茶叶及代用茶中游离氨基酸组成和含量丰富，对茶汤的鲜爽特征风味和生物活性功能的形成具有显著影响，是茶叶的重要品质指标。随着LC-MS/MS 技术的不断发展，游离氨基酸检测方法正在向无须衍生、操作简便、选择性好、灵敏度和准确性高的方向发展。HILIC 分离模式结合MS/MS 技术将会使茶叶中游离氨基酸分析在灵敏度、准确度、选择性和实用性方面均提高到一个崭新的水平。