中药单体作用于外泌体治疗非小细胞肺癌的机制研究进展

王宇阳，汪丫婷，蒿艳蓉，侯恩存

1 广西中医药大学研究生院，南宁 530000；2 广西壮族自治区人民医院临床肿瘤中心；3 广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科

肺癌在组织病理学分型上分为小细胞肺癌及非小细胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC 占80%～85%。NSCLC 治疗难度较大，预后不佳，近年来以外泌体为代表的细胞外囊泡作为新兴热点越来越多地应用于NSCLC 的免疫治疗中。细胞外囊泡可以被所有细胞释放，具有内在的生物相容性、细胞靶向性、低免疫原性，根据其生物发生行为和直径可分为外泌体（直径30～150 nm）、微囊泡（直径100～1 000 nm）、凋亡小体（直径100～5 000 nm）及癌小体（直径1～10 µm）。既往研究表明，细胞表面结构可以引导细胞外囊泡摄取到特定细胞，保护治疗剂免受吞噬细胞识别，从而使治疗剂在健康细胞及组织中的半衰期更长，不良反应更少［1］。外泌体是目前研究最为广泛的细胞外囊泡，具有较强的渗透性及保留率，并且具有独特的免疫监视特性［2］。外泌体的转运可以使部分生物信息分子激活细胞表面受体，协助外泌体内容物进入靶细胞内，从而调节靶细胞的生理功能。中药单体是单味中药提取的有效活性成分，与中药复方相比具有功效明确、药理机制清晰、用量可控等优势，近年来一直活跃在肿瘤治疗用药行列中。中药单体可作用于外泌体影响NSCLC 细胞的生物活性、代谢、迁移及药物敏感性，其中紫杉醇（PTX）、桔梗皂苷、紫草素、黄芪多糖（APS）等以其自身特性在NSCLC 中被广泛研究。现就中药单体作用于外泌体治疗NSCLC的机制综述如下。

1 PTX作用于外泌体治疗NSCLC的机制

PTX是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯的天然中药单体，经临床验证可通过诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、调节微管系统、调节免疫等机制发挥抗肿瘤的作用［3］。PTX 和铂类是治疗NSCLC 的一线方案，虽然PTX 等化疗药物在NSCLC 的治疗中取得了良好的疗效，但PTX 的非特异性循环引起的全身毒性往往引起多器官损伤，其中包括强烈的消化道反应、严重的肝肾毒性及明显的骨髓抑制。目前，围绕PTX 开展的外泌体免疫治疗机制越来越多地被研究者发现。

1.1 搭载间充质干细胞（MSC）衍生外泌体 MSC存在于几乎所有人类组织的血管周围生态位中，MSC 具有自我更新、再生和修复缺陷细胞的能力以及分化为骨骼、软骨、血管和心肌细胞的可塑性。MSC 对疾病的治疗作用是通过其旁分泌功能实现的，旁分泌过程中细胞分泌物通过直接扩散作用于邻近细胞。MSC 与肿瘤部位具有先天亲和力，可以调节与癌症相关的多种生物学过程，如转移、血管生成、上皮—间充质转化等［4］。MSC 衍生的外泌体显示出高效的生物相容性和较低的内在免疫原性，是肿瘤治疗中有价值的药物递送载体［5］。MELZER等［6］研究表明，与单独PTX 处理比较，搭载高浓度PTX 的MSC 衍生外泌体处理的NSCLC 细胞增殖受到更多抑制，提示搭载高浓度PTX 的MSC 衍生外泌体在体外显示出更强的NSCLC 细胞杀伤效率。同时，MSC 外泌体中的PTX 浓度比PTX 物质在体外产生同等细胞毒性的浓度低7.6 倍。在小鼠体内使用MSC 产生的PTX 外泌体后，至少在肺、肝、脾和肾中观察到PTX 远处器官转移量减少了50%；且与使用单独PTX 处理比较，达到相同效果的外泌体中的PTX 浓度显著降低，提示MSC 外泌体具有特异性和更高效的肿瘤靶向特性。由上可见，搭载PTX 的MSC 衍生外泌体对NSCLC 细胞具有显著的细胞杀伤效率、高效的屏障通过率、强靶向性和高生物保有率。

1.2 搭载氨基乙基乙醇胺（AA）-聚乙二醇（PEG）矢量化外泌体 既往研究表明，包括非小细胞肺癌在内的多种癌症sigma 受体都存在过度表达，AA 是一种对sigma 受体具有高亲和力的配体，已被用于靶向递送阿霉素、蛋白质和siRNA［7］。KIM 等［8］开发并优化了PTX 负载外泌体的配方，该外泌体结合了AA及PEG载体片段以靶向肺癌细胞过表达的sigma受体。搭载PTX 的AA-PEG 矢量化外泌体AA-PEGexoPTX 具有高负载能力，在全身给药后能够在肿瘤细胞中积累，显著增强治疗效果，体现了其强靶向和高负载能力。

1.3 搭载Lip-CExo@PTX 嵌合抗原受体T 淋巴细胞（CAR-T）免疫疗法，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，其中T 淋巴细胞通过基因工程来表达靶向肿瘤相关抗原的CAR 蛋白，细胞衍生的外泌体具有良好的抗肿瘤作用，因为其继承了来自亲代细胞的细胞毒性颗粒及靶向CAR蛋白［9］。载药效率相对较低一直是外泌体作为药物载体所面临的一个困境，脂质体作为一种常规的药物载体，已广泛应用于化疗药物的递送。与外泌体相比，脂质体具有载药效率高、可大规模生产等优点［10］。ZHU［11］等设计了混合纳米囊泡，将CAR-T 衍生的外泌体CAR-TExos及肺靶向脂质体Lip-CExo 共压，用于PTX 递送，即Lip-CExo@PTX。外泌体从表达单链可变片段的双特异性MSLN/程序性死亡受体配体1（PD-L1）CART 培养基中分离出来，通过继承脂质体对肺部的靶向能力，Lip-CExo@PTX 在静脉给药后迅速积聚在肺部。积累的Lip-CExo@PTX 将PTX 和细胞毒性颗粒（颗粒酶B 及穿孔素）通过CAR-TExos遗传的抗间皮素单链Fvs传递给间皮素阳性肿瘤细胞。同时，PTX溶解细胞后诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，吸引更多浸润性淋巴细胞进入肿瘤组织，并产生损伤相关分子标志物（DAMP），DAMP 刺激巨噬细胞、DC 及NK细胞，导致T 淋巴细胞活化并启动免疫反应［12］。更重要的是，Lip-CExo@PTX 表面的抗PD-L1-scFvs 被肿瘤的PD-L1 阻断，减少了浸润性T 淋巴细胞的衰竭，进而增强了免疫应答。所以Lip-CExo@PTX 具有直接杀伤肿瘤细胞及增强免疫应答的能力，同时具有更强的肿瘤靶向性、良好的生物相容性及重塑肿瘤微环境等多种抗肿瘤特性。

1.4 PTX@CAR-Exos 雾化吸入 在静脉给药的基础上，ZHENG 等［13］考虑到肝肾毒性等不良反应，选择设计雾化吸入式PTX@CAR-Exos。通过对CARExos 的主动识别和吸入的被动运动，雾化吸入式PTX@CAR-Exos 的总体疗效较静脉给药的PTX@CAR-Exos表现出更高的靶向作用及更低的不良反应。

2 桔梗皂苷作用于外泌体治疗NSCLC的机制

桔梗是一种药食两用的传统中草药，桔梗皂苷D（PD）是桔梗中的主要活性成分，其含有一个双糖链齐墩果烷型苷元，属于五环三萜皂苷家族［14］。现代药理学研究表明，PD 能诱导肿瘤细胞分裂障碍及凋亡，并能抑制肿瘤细胞生长，降低集落形成［15］。在包括NSCLC 在内的多种恶性肿瘤的治疗中，程序性细胞死亡因子1（PD-1）/PD-L1抑制剂已被证实具有良好的抗肿瘤作用，但PD-1/PD-L1 靶点由一个疏水、大而扁平的蛋白质—蛋白质相互作用而构成，因此可干预药物的设计难度较大。在这种情况下，可以特异性降低细胞膜上PD-L1来发挥免疫治疗作用的天然产物引起了关注。HUANG 等［16］研究表明，由PD 处理的NSCLC 细胞PD-L1 蛋白通过外泌体途径释放于细胞外，细胞内PD-L1蛋白水平降低，同时活化了人白血病T 淋巴细胞，进而增强了白细胞介素2（IL-2）的分泌，促进了多种淋巴细胞的生存和增殖。且PD 通过外泌体途径降低PD-L1 蛋白表达的同时，并不降低PD-L1 mRNA 水平，也不促进PD-L1蛋白降解，更与溶血机制无关。BAILLY 等［17］关于PD 促进PD-L1 细胞外释放机制的研究得到以下两个观点：①金属蛋白酶或药物直接促进膜表面蛋白脱落形成可溶性PD-L1；②PD 通过消耗脂筏中的胆固醇和诱导蛋白在脂筏中以重新分布的方式干扰膜筏的结构域，阻止Toll 样受体4（TLR4）转位进入脂筏，进而限制了TLR4 等蛋白质的募集。PD 的PDL1 释放作用至少部分源于胆固醇依赖性膜过程，该过程导致PD-L1 和其他膜蛋白形成囊泡，PD 在调节膜筏蛋白分布过程中限制TLR4 等蛋白质募集促使PD-L1 等蛋白质释放到膜囊泡中。由上可见，PD 能够通过干扰膜筏结构域促进NSCLC 细胞PD-L1 蛋白外泌体细胞外释放，同时活化免疫系统，进而治疗NSCLC。

3 紫草素作用于外泌体治疗NSCLC的机制

紫草是多年生草本植物，其有效成分是萘醌类化合物紫草素。ZHANG 等［18］研究发现，紫草素在治疗NSCLC 中具有抑制细胞增生、阻滞细胞周期及促进细胞凋亡等作用。异常代谢是肿瘤细胞最重要的特征，肿瘤细胞以及所有增殖细胞的代谢都会促进营养物质的摄取和吸收，以便于合成新生物质（如脂质、核苷酸和氨基酸）供细胞所需。缺氧是大多数恶性肿瘤中常见的现象，参与肿瘤耐药及生长［19］。而肿瘤细胞在氧条件充足并可以支持线粒体氧化磷酸化的状态下，也倾向于将葡萄糖糖酵解成乳酸。丙酮酸激酶同工酶M2（PKM2）作为介导糖酵解最关键的限速酶［20］，是Warburg 效应的重要调控因子，可催化磷酸烯醇丙酮酸合成丙酮酸，促进厌氧糖酵解，在肿瘤细胞中还可触发独特的有氧糖酵解进而促进肿瘤细胞生长，糖酵解终产物乳酸的产生与恶性肿瘤的发生发展及耐药密切相关。WANG 等［21］研究显示，PKM2 在缺氧顺铂耐药细胞分泌的外泌体中表达增加，缺氧诱导的外泌体PKM2 在体外及体内将顺铂耐药性传递给敏感的NSCLC 细胞，从而加剧了NSCLC 细胞的顺铂耐药性。从机制上讲：①缺氧诱导的外泌体PKM2可促进NSCLC细胞的糖酵解产生还原代谢物，这可能中和顺铂诱导的活性氧生成增加。②缺氧诱导的外泌体PKM2 以PKM2-BCL2 依赖性方式抑制细胞凋亡。③缺氧诱导的外泌体PKM2 重编程癌症相关成纤维细胞，以产生促进NSCLC 细胞增殖及顺铂耐药的酸性微环境。既往研究显示，紫草素对肿瘤特异性PKM2 有抑制作用，其中以烷烃素的抑制作用最强。DAI等［22］研究也发现紫草素是一种潜在的PKM2 抑制剂，能通过抑制NSCLC 细胞外泌体中PKM2的表达来抑制有氧糖酵解，进而抑制NSCLC 细胞生长；也能通过抑制外泌体中PKM2 表达来减缓外泌体耐药性传递过程，进而减缓NSCLC顺铂耐药。

4 APS作用于外泌体治疗NSCLC的机制

黄芪为多年生草本豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，主要活性成分为皂苷类、多糖类、氨基酸类和黄酮类等。APS 是黄芪多种多糖的统称，现代药理研究发现其能增强机体免疫功能，通过靶向调控肿瘤微环境的细胞、细胞因子及细胞外基质，抑制肿瘤微环境的炎症反应，诱导细胞凋亡以及逆转化疗耐药性，从而达到抗肿瘤效果［23］。肿瘤微环境是肿瘤演化的关键因素，其由肿瘤细胞、炎症细胞、细胞外基质、血管内皮细胞、免疫浸润细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、炎症因子和低氧酸性环境构成。炎症反应是机体应对感染和组织损伤的适应性反应，以血管反应、免疫细胞的募集及分子介质的释放为主要特征，而肿瘤相关性炎症是癌症的关键特征之一。脂多糖（LPS）是一种常见的内毒素，TLR4 是Toll 样模式识别受体一个亚型，LPS 是激活TLR4 常见的致炎因子。LPS 刺激TLR4 后，可以激活核转录因子κB（NF-κB）信号通路，释放大量炎症因子，NFκB 信号通路可以调控PSMC3、PSMC5、PSMB4 等蛋白酶受体［24］。NAKANISHI 等［25］研究表明，TLR4 在慢性炎症状态下的NSCLC 中表达增强。DOMENIS研究表明［26］，TLR4 激活的肿瘤来源外泌体作用于T淋巴细胞发挥免疫抑制功能，LPS 也可以改变层粘连蛋白分布，层粘连蛋白α1（LAMA1）及层粘连蛋白α5（LAMA5）是层粘连蛋白的2 个亚基，在细胞迁移黏附过程中起重要作用。纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，在多种不同的肿瘤中上调，并具有多种促肿瘤功能，包括支持细胞增殖和血管生成、抑制细胞凋亡和促进转移等，肿瘤细胞及肿瘤微环境中的组分均可以分泌PAI-1［27］。胡康蝶等［28］研究表明，LPS 引导的炎症状态下NSCLC细胞外泌体释放数目增多且多种蛋白结构发生显著变化，而经APS 处理后，NSCLC 细胞外泌体释放缓慢增加但蛋白结构变化明显减少，LAMA1、LAMA5等蛋白在LPS 处理的外泌体中表达下调，炎症状态下的PAI-1 在外泌体中表达上升；分析APS 作用后的外泌体差异蛋白后发现PSMC3、PSMB4、PSMC5等蛋白酶体关键蛋白表达均向对照组回归，提示APS 通过调节外泌体释放来缓解肿瘤相关炎症反应，进而抑制NSCLC细胞生长和迁徙。

综上所述，PTX、桔梗皂苷、紫草素及APS 等中药单体均能通过直接搭载或间接调节的方式作用于外泌体，进而抑制NSCLC 细胞生长、迁移及耐药性。本综述仍存在以下问题：①某些机制方面存在一些争议或尚未明确探知，缺乏细胞实验数据论证，有待进一步细胞实验论证。②大部分数据都来源于动物细胞实验，缺少足够的人体试验数据，有待转化医学跟进Ⅰ、Ⅱ期临床试验，通过更多临床试验数据论证以上观点。