腺病毒介导的血管内皮生长因子联合干细胞生长因子治疗严重肢体缺血的实验研究

钟睿 王家宁 张蕾 郭凌郧 杨建业 郑飞 晏誉文 余丹丽 谭利国

湖北医药学院附属人民医院1心内科，2临床研究所，3消化内镜中心 （湖北十堰 442000）

近年来缺血性疾病在临床上愈发多见［1］，其中由严重肢体缺血（CLI），导致的截肢、致死事件受到了重点关注［2］，其危害性不逊于冠心病或中枢血管疾病［3-4］。目前CLI主要治疗方式包括外科手术治疗、药物治疗、腔内介入手术治疗等［5］，但远期效果均不十分理想［6］，1年肢体保存率仅为5%［7］，如何提高CLI的治疗效果一直困扰着临床医师。CLI治疗的关键在于血管重建，近年来以进血管生成生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）为目标的基因治疗已经成为CLI治疗研究的热点［8-9］。VEGF可作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，诱导血管新生［10］，是当前研究较多的促血管生成因子。动物实验指出VEGF可通过激活动脉特殊信号增加血管密度，调控动脉形成［11］。临床研究［12］则发现，肌肉内注射质粒VEGF治疗血栓闭塞性脉管炎的效果显著，可减轻患者静息痛，降低患者截肢风险。HGF同样是一种强效促血管生成因子，国外研究［13-14］已证实，肌肉注射裸体HGF质粒可显著改善肢体缺血，且治疗安全性良好，但目前鲜有将两种促血管因子联合用于治疗CLI的相关报道。本研究将从细胞学实验和动物实验模型的基础上探讨腺病毒介导的VEGF-HGF（Ad-VEGF-HGF）基因治疗对缺血组织血管生成的影响，以期为临床治疗CLI提供一种新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验用基因本实验所用基因Ad-VEGF、Ad-HGF、Ad-VEGF-HGF由湖北医药学院附属十堰人民医院临床研究所提供，通过实验动物福利伦理委员会审查（编号：2023010）。

1.2 试剂BCA试剂盒，ECL化学发光试剂盒（Yeasen 公司，36208），兔α-Tubulin 抗体（Sigma 公司，05-829），兔VEGFA多克隆抗体（武汉三鹰公司，19003-1-AP），兔HGF多克隆抗体（Abcam 公司，ab24865），辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的羊抗抗小鼠（Jackson公司，C0152）及羊抗兔二抗（Jackson公司，C0151），兔CD31多克隆抗体（Abcam 公司，ab32457），小鼠SMA单克隆抗体（Santa Cruz公司，sc-53142），小鼠VEGF（武汉欣博盛，EMC103.48）及HGF ELISA试剂盒（武汉欣博盛，EMC037.48）。

1.3 构建下肢缺血模型昆明小鼠84只，SPF级，6 ～ 8周龄，体质量22 ～ 30 g，购于湖北积步医疗科技有限公司，喂养于湖北医药学院附属人民医院动物实验动物中心。将84只昆明小鼠随机分为假手术组4只，空白对照组、VEGF组、HGF组、VEGF+HGF组各20只小鼠。

异氟烷气体麻醉，常规消毒，以左下肢近卵圆窝处为起点，剪开皮肤，钝性剥离，充分暴露股动脉和静脉，使用4-0无菌缝合线结扎股动脉及静脉制备下肢缺血模型。将0.5 mL 1010 pfu：Ad-VEGF，Ad-HGF，Ad-VEGF-HGF以盐水5 mL稀释10倍注入对应分组小鼠左下肢肌肉中，每只小鼠注入0.2 mL。后于术后7、14、28 d分次用测下肢血流量，计算左侧患肢与右侧健肢血流比值。

1.4 HE染色和免疫组化将石蜡包埋好的各组腓肠肌组织按5 μm/片进行连续切片。将切片置于二甲苯溶液中浸泡20 min，随后按照降浓度梯度原则先后将切片置于无水酒精、95%酒精、75%酒精、45%酒精中浸泡5 min，最后将切片转至蒸馏水中浸泡5 min，最后再进行切片染色。HE染色将切片先用苏木精染液染色15 min，1%盐酸酒精分化10 s，然后再用1%伊红染色3 min，最后用酒精梯度脱色后树脂封片，显微镜下观察并拍照。

免疫组化：切片常规脱水后，首先利用0.01 mol枸橼酸钠缓冲液（pH为6.0）进行抗原修复，3%H2O2溶液封闭内源性过氧化氢酶，然后分别加小鼠CD31多克隆抗体（1∶200）及小鼠SMA多克隆抗体（1∶100），37 ℃恒温环境中孵育40 min，PBS冲洗3 ～ 4次，每次5 min，后向每张切片上滴加50 μL HRP-羊抗小鼠二抗，室温避光孵育20 min，PBS清洗3次，每次5 min。最后用DAB显色液，显微镜下观察并照相，计数新生血管。

1.5 Western blot提取各组小鼠左侧下肢腓肠肌组织蛋白，BCA工作液测定蛋白浓度，然后按每孔20 mg的量进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将含有蛋白的凝胶转印至PVDF膜上，将膜用5%的脱脂奶粉室温孵育30 min进行封闭，然后加入兔VEGFA抗体多克隆抗体（1∶500），兔HGF多克隆抗体（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次后，室温孵育二抗2 h，ECL化学发光试剂显影并拍照。

1.6 ELISA使用ELISA法检测Ad-VEGF-HGF小鼠血清的VEGF和HGF的表达水平，操作严格按照说明书进行。建模24 h后，采集各组小鼠左心血（5 mL），分离血浆。空白孔中滴加标准品，其余反应孔中加入不同浓度的标准液或标本溶液，每个反应孔中液体量均为100 μL/孔，随后用用封板胶纸封闭反应孔，将孔板置于36 ℃恒温孵育90 min，每个实验组3个重复。流水冲洗5次后，向每个反应孔中滴加生物抗体工作液100 μL，封板，36 ℃恒温孵育30 min。100 μL/显色底物36 ℃恒温孵育15 min，最后每个反应孔中滴加100 μL终止液，振荡混匀后上机，检测OD450值并记录。

1.7 安全性分析统计建模成功率以及各组小鼠治疗期间有无不良反应发生。

1.8 统计学方法使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组间对比采用重复测量的方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 9.4版本软件对图形进行绘制。

2 结果

2.1 缺血后肢血流流量建模成功后，各组小鼠缺血后左下肢血流流量均显著下降；术后第7天，各组小鼠缺血后左下肢血流流量均明显优于术后即刻（P＜ 0.05），且Ad-VEGF-HGF组小鼠缺血后左下肢血流流量明显优于其他各组（P＜ 0.05）；术后第28天 Ad-VEGF-HGF组小鼠缺血后左下肢血流流量逐步稳定，组间对比差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表1及图1。

表1 建模前后左侧缺血肢体血流流量/右侧健肢血流流量Tab.1 Blood flow of left ischemic limb / right healthy limb before and after modeling ±s

表1 建模前后左侧缺血肢体血流流量/右侧健肢血流流量Tab.1 Blood flow of left ischemic limb / right healthy limb before and after modeling ±s

注：与术后即刻相比，#P＜0.05；与同期空白对照组相比，*P＜0.05。与同期VEGF组相比，△P＜0.05；与同期HGF组相比，▲P＜0.05

时间空白对照组VEGF HGF VEGF+HGF术后第28天0.82 ± 0.76#0.89 ± 0.85#0.86 ± 0.82#0.97 ± 0.93#*术前1.03 ± 0.98#1.05 ± 1.03#0.99 ± 0.97#1.02 ± 0.98#术后即刻0.47 ± 0.40 0.40 ± 0.36 0.36 ± 0.34 0.42 ± 0.40术后第7天0.67 ± 0.61#0.69 ± 0.68#0.65 ± 0.63#0.80 ± 0.77#*△▲术后第14天0.79 ± 0.74#0.89 ± 0.85#0.85 ± 0.83#0.99 ± 0.95#*

图1 缺血后下肢血流流量比值Fig.1 Lower limb blood flow ratio after ischemia

2.2 Western blot术后第7、14、28天时假手术组、对照组的HGF、VEGF的表达水平最低，Ad-HGF组、Ad-VEGF组、Ad-VEGF-HGF组HGF蛋白、VEGF蛋白表达水平均明显高于对照组（P＜ 0.05），且术后第14天Ad-VEGF-HGF组的表达水平达到相对峰值，见图2-4。

图2 Western blot检测Fig.2 Western blot detection

图3 术后各组不同观察节点VEGF、HGF表达水平Fig.3 Expression levels of VEGF and HGF at different observation nodes in each group after operation

图4 VEGF-HGF组术后不同观察节点VEGF、HGF蛋白表达水平Fig.4 VEGF and HGF protein expression levels at different observation nodes in vegf-hgf group after operation

2.3 ELISA检测注射Ad-VEGF-HGF组小鼠VEGF蛋白、HGF蛋白表达水平在术后第7天开始逐步升高，并于术后第14天达到相对峰值，术后第28天时表达水平逐步降低，术后第14天时与其他各时间节点表达水平相比差异均有统计学意义（P＜ 0.001），见表2及图5。

表2 VEGF、HGF蛋白表达水平变化Tab.2 Changes of VEGF and HGF protein expression levels ±s

表2 VEGF、HGF蛋白表达水平变化Tab.2 Changes of VEGF and HGF protein expression levels ±s

注：与术后第14天相比，#P ＜ 0.05

指标VEGF HGF P值＜ 0.001＜ 0.001术前34.24 ± 1.05#1.89 ± 0.80#术后第7天36.99 ± 9.80#5.19 ± 1.75#术后第14天88.79 ± 23.22 7.26 ± 0.38术后第28天23.98 ± 0.46#4.20 ± 0.73#F值83.86 14.01

图5 ELISA检测Fig.5 Changes of detected by ELISA

2.4 免疫组化法检测缺血后下肢新毛细血管密度术后第7天、术后第14天、术后第28天时观察和计数新生血管，Ad-VEGF-HGF组血管新生较为明显且数量较多，组间a-SMA所标记新生血管水平差异有统计学意义（P＜ 0.001），其中对照组各时期的a-SMA所标记新生血管水平最低，术后第14天VEGF+HGF所标记新生血管水平最高，见图6。

图6 SMA水平Fig.6 Levels of SMA

免疫组化CD31染色结果显示，术后第7天、第14天、第28天时观察和计数新生血管，组间CD31所标记新生血管水平差异有统计学意义（P＜ 0.001），其中对照组各时期的CD31所标记新生血管水平最低，术后第14天Ad-VEGF-HGF组的CD31所标记新生血管水平处于相对峰值，见图7。

图7 CD31水平Fig.7 Levels of CD31

3 讨论

CLI的主要治疗方法是恢复患肢血流，缓解缺血疼痛症状，血运重建，具体方法包括外科手术治疗以及药物治疗等［15］，但临床观察发现部分CLI患者临床获益并不显著，截肢率并未见显著下降［16-17］。随着医疗技术的不断发展，基因治疗逐渐展示出优势［18］，血管生成基因治疗试验被视为对不同类型缺血的一种较有前景的新兴疗法［19］，其中VEGF和HGF基因是目前研究最多的基因［20-21］，MÄKINEN等［22］使用经皮腔内血管成形术向CLI患者注射重组腺病毒-VEGF165基因，结果显示这两种基因工程构建体能增加血管化。BARĆ等［23］研究指出，与VEGF相比HGF可能在血管生成过程中发挥了更为重要的作用，且HGF对血管内皮细胞的促进和增殖作用强于VEGF［24］，故HFC可能是治疗缺血性疾病中某些关键因素。基于上述研究推测VEGF与HGF在促进血管新生方面具有协同增效作用，联合这两种基因有望进一步提高CLI的治疗效果，但目前尚且缺乏实验论证。

本研究Western blot检测结果证实Ad-VEGFHGF组小鼠体内VEGF、HGF蛋白持续高表达，术后第14天后即达相对峰值，此后逐渐降低，除术后第28天外，Ad-VEGF-HGF组小鼠体内VEGF、HGF蛋白表达水平均明显高于其他各组。同时，研究通过血流仪探测发现，术后第14天时，Ad-VEGF-HGF组小鼠的血流流量便出现了明显恢复，血流恢复速度明显优于VEGF组、HGF组及对照组，这与Ad-VEGF-HGF组VEGF、HGF蛋白的表达状态变化基本一致，由此可见Ad-VEGF-HGF双基因注射后可发挥协同作用，进一步上调VEGF蛋白和HGF蛋白的表达水平，另一方面也证实了HGF和VEGF均可促进血管新生，这与RIAUD等［25］动物实验结果较为类似，该研究指出VEGF和HGF基因的共转移在缺血性骨骼肌中产生了强大的血管生成效应，并可能成为治疗缺血性疾病的潜在治疗组合。但在促进血管新生过程中，是VEGF还是HGF发挥了主导作用尚且无法明确。安全性一直以来都是基因治疗重点关注的问题。早期病毒载体的基因治疗研究［26］指出以腺病毒为载体进行VEGF基因治疗冠心病缺血的效果良好，且未发生严重不良反应，而本研究以腺病毒为载体联合了VEGF基因和HGF两种基因，这两种基因是否会增加基因治疗风险着实需要重点关注。本研究结果显示小鼠建模成功，各组小鼠实验期间均未出现严重不良反应，未出现死亡小鼠，由此可见Ad-hVEGF-hHGF基因治疗的安全性。

本研究的局限性在于未明确VEGF联合HGF如何调节血管内皮细胞功能，促进血管内皮细胞增殖，哪种基因发挥了主导作用，作用剂量是否会对其促血管作用产生影响等，上述问题仍有待今后进一步深入探究。

综上所述，Ad-VEGF-HGF基因注射可显著提高小鼠体内VEGF和HGF蛋白的表达水平并快速达到相对峰值水平，继而进一步促进下肢缺血后的血管生成，增加血流量，改善下肢循环。