基于代谢组学的补骨脂素在2D和3D培养模型的肝毒性差异研究

蒲位凌,夏 宁,张孝莹,张 玥,周 昆,3

(1. 天津中医药大学中医药研究院,2. 组分中药国家重点实验室,3.现代中医药海河实验室,天津 301617)

中药补骨脂具有温肾助阳,纳气等作用,主治阳痿遗精,腰膝冷痛,肾虚作喘等。补骨脂及其方剂的不当使用有造成肝损伤的风险。补骨脂素是补骨脂药材的主要活性成分之一,同时也是导致补骨脂肝毒性的主要成分之一[1]。

体外毒性实验具有速度快、成本低、通量高等优势,但不能很好地模拟体内环境,常导致体内外毒性评价结果不一致的问题。近年来,研究人员开发了更符合体内特征的体外三维(3D)培养模型,能够模拟在体特征[2]。本研究建立小鼠正常肝细胞3D培养模型。从代谢角度阐述不同培养模型下的毒性差异,评价哪种培养模式下更贴近在体研究结果。

1 材料与方法

1.1 3D培养与药物处理小鼠正常肝细胞(AML12,SCSP-550)购自中国科学院干细胞库,使用U型低吸附板构建并改进多细胞3D培养模型。细胞暴露于补骨脂素(成都格利普生物科技有限公司,终浓度为10～400 μmol·L-1)0 ～5 d。收集上清进行代谢物分析。

1.2 细胞活力分析用CCK-8法评估补骨脂素处理后的AML12细胞活力。于相应时间点,每孔加CCK-8 试剂10 μL,孵育1～4 h,酶标仪检测450 nm处的吸光度。

1.3 代谢物分析、数据处理和统计分析细胞培养上清用乙腈沉淀蛋白后,进行LC-MS/MS检测。代谢物检测方法按照SCIEX公司的“细胞培养基/上清液成分分析方案”进行。原始质谱数据由Analyst Software 1.6.1收集处理。数据归一化后,导出到SIMCA-P V14.0进行多元统计分析, MetaboAnalyst进行通路分析。

2 结果

2.1 补骨脂素对2D和3D培养细胞活力的影响在2D体系下,400 μmol·L-1补骨脂素对AML12细胞活力有抑制作用,且随着时间的推移抑制作用逐渐明显。补骨脂素在200 μmol·L-1下对AML12细胞无明显抑制作用。而在3D体系下,10 μmol·L-1补骨脂素即可引起细胞活力抑制,肝细胞在10 μmol·L-1补骨脂素暴露72 h后,细胞活力与空白组相比下降约25%。综上所述,3D培养的AML12细胞对补骨脂素具有较高的敏感性。

2.2 AML12细胞在不同培养模型下的代谢组学研究在2D培养下,补骨脂素处理 72 h后,100 μmol·L-1处理组的代谢谱与其他各组分离。而在3D培养模型中,补骨脂素组(包括10 μmol·L-1组)在24 h时即与对照组分离,说明低剂量的补骨脂素引起了内源性代谢物的变化。即在3D系统下,10 μmol·L-1补骨脂素虽然不会造成明显的细胞活力抑制,但是却引起了细胞内源性代谢物的变化。

2.3 潜在生物标志物的鉴定基于OPLS-DA中的VIP>1和P<0.05,确定了毒性生物标志物。在2D模型中,补骨脂素暴露后24 h后,共鉴定出12个差异代谢物,其中100 μmol·L-1组鉴定出3个(维生素B2、柠檬酸和烟酸);3D培养模型中共鉴定出5个差异代谢物(异柠檬酸、维生素B1盐酸盐、柠檬酸、肌酐、葡萄糖酸)。补骨脂素在不同培养模式下对代谢轮廓的影响是不同的。

2.4 通路富集分析MetaboAnalyst分析显示,2D培养第1天核黄素代谢和TCA循环是补骨脂主要影响的代谢途径。而到第3天,干扰最大的途径变成甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。而在3D培养模式下,TCA循环一直是受干扰最明显的途径。

3 讨论

代谢紊乱是肝损伤的特征之一,我们前期研究表明补骨脂素可引起血清和肝脏的氨基酸代谢紊乱,特别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成紊乱[2-3]。本研究探索了补骨脂素在不同培养模型下对正常肝细胞AML12的代谢谱的改变,但在2D和3D培养模式下,对代谢谱的影响是不同的。3D培养是近几十年来发展起来的一种更加接近体内微环境的离体培养系统,对外界刺激的反应更敏感[2]。本研究发现,随着时间的推移,补骨脂素的肝细胞毒性在3D培养模型中更加明显,即在低剂量(10 μmol·L-1)时,细胞活力就明显下降。与补骨脂素暴露相关的核心代谢过程是TCA循环。补骨脂素暴露初期,低剂量补骨脂素对细胞活力无影响,但在3D模型中TCA循环受损。而在2D培养模型下,对TCA循环无明显影响。这种差异可能是造成补骨脂素在2D或3D培养模型不同敏感性的原因之一。最新研究发现,补骨脂素可以直接与肝脏CYP2D6、CYP3A4、GST结合,抑制其活性,导致体内谷胱甘肽(GSH)的消耗,从而引起肝损伤[4]。本研究在3D培养模型下得到的体外代谢扰动结果,侧面佐证了补骨脂素对GSH的耗竭[4]。前期研究也发现,补骨脂素造成的线粒体动态平衡破坏而诱发的细胞凋亡是造成其肝毒性的因素之一[5]。补骨脂素造成TCA循环障碍,也与补骨脂素造成线粒体损伤的结果相印证。

综上所述,本研究表明正常肝细胞的3D培养比传统的2D系统对补骨脂素毒性具有更高的敏感性。本研究可为中药毒性评价的新策略的开发提供参考。