次苷酸查尔酮对LPS诱导的RAW264.7 细胞iNOS和COX-2表达的影响

王 萌,高盼微,罗子娟,常惠琳,张 玥,袁 庆,柴丽娟

(天津中医药大学组分中药国家重点实验室,方剂学教育部重点实验室,天津市中药药理学重点实验室,天津 301617)

补骨脂为豆科植物补骨脂 (PsoraleacorylifoliaL.)果实,具有温肾助阳、温脾止泻的功效[1],临床上被用于治疗皮肤病、肾炎、骨折等[2-3]。次苷酸查尔酮(corylifol A,CYA) 是中药补骨脂的活性成分之一,是一种异黄酮类化合物,具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗骨质疏松的特性[4-5]。有研究表明,CYA能明显抑制破骨细胞的分化,且能明显降低 LPS诱导的巨噬细胞一氧化氮(NO)的生成[6-7]。前期课题组对补骨脂成分CYA的抗炎活性进行初步研究,发现CYA能抑制LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β释放,初步表明其有一定的抗炎活性[8]。巨噬细胞中由iNOS和COX-2诱导的NO过度表达在炎症性疾病的发展中起着关键作用[9],本实验通过 LPS诱导 RAW264.7细胞建立炎症模型,考察CYA对炎症因子NO、 iNOS、COX-2等表达的影响,以此来探讨CYA的抗炎作用,为CYA的开发研究奠定基础,同时为补骨脂的临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞株小鼠RAW264.7巨噬细胞株,中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2 药物和试剂Corylifol A(购自中国食品药品检定研究院,纯度(HPLC)≥98%);LPS (#L2880,Sigma);MTT(#M5655,Sigma);高糖DMEM培养基(#C11995500BT)、FBS (#10099-141)均购于Grand Island;BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);NO检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司);β-actin (#4967,美国CST公司);iNOS(#ab178945)、COX-2 (#ab179800)均购于Abcam。

1.3 仪器倒置相差显微镜(日本Nikon公司);CO2恒温培养箱(美国 THERMO 公司);酶标仪(瑞士TECAN 公司);5418R型小型高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司);电泳仪(美国 Bio-Rad 公司);Western blot凝胶成像系统(美国GE公司)。

2 方法

2.1 细胞培养将RAW264.7细胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基中,在37 ℃、含5% CO2培养箱中培养至80%左右传代。

2.2 细胞分组处理对照组:正常培养细胞24 h。模型组(LPS组):细胞正常培养24 h后,加入62.5 μg·L-1LPS继续培养24 h。给药组:细胞正常培养24 h后,加入含有不同浓度CYA的培养基,使CYA溶液的终浓度分别为0.01、0.1、1 μmol· L-1,处理4 h后,然后加入62.5 μg·L-1的 LPS,继续培养24 h。

2.3 MTT检测细胞存活率按照“2.2”细胞分组实验,细胞分别培养24 h后,向每个孔中加入100 μL MTT,37 ℃孵育4 h,弃去上清液,再加入200 μL DMSO,轻微振摇10 min,用酶标仪在490 nm处检测各孔的吸光度(A)值,并计算细胞存活率。细胞存活率=(A给药-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

2.4 Griess检测NO浓度RAW264.7细胞接种于96孔板,按“2.2”中的方法分组培养24 h后,取上清50 μL,在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ,Griess Reagent Ⅱ,混匀,在540 nm处测各孔的吸光度(A)值,并计算其NO的含量。

Tab 1 Effects of CYA on cell viability,NO,iNOS,COX-2 in LPS-induced RAW264.7 cells

2.5 Western blot检测iNOS和COX-2蛋白表达水平将RAW264.7细胞以1×109L-1的密度接种在6孔板中,并根据“2.2”中的方法对其进行分组,培养24 h之后,用 PBS清洗,加入100 μL的裂解液,12 000 r·min-1,4 ℃离心20 min,取上清,BCA法进行蛋白定量,取蛋白样品电泳,转膜,封闭,加入一抗孵育过夜,用TBST洗膜3次,加入二抗反应1 h,用TBST洗涤4次,凝胶成像系统显色曝光,β-actin作为内参,分别计算各组细胞蛋白表达水平,ImageJ软件用于灰度值分析。

3 结果

3.1 CYA对RAW264.7细胞活力的影响通过MTT实验来评估CYA对细胞活性的影响,实验结果如Tab 1所示,62.5 μg·L-1的LPS以及CYA在 0.01～1 μmol·L-1的范围内对RAW264.7细胞存活率无明显影响,表明62.5 μg·L-1的LPS以及CYA在浓度 0.01～1 μmol·L-1的范围内对细胞均不具有细胞毒性作用。

3.2 CYA对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中NO含量的影响如Tab 1 所示,与Control比较,LPS处理后模型组细胞NO的含量上升(P<0.01);与Model组比较,给药组细胞NO的含量明显下降(P<0.05)。

3.3 CYA对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS表达的影响如Tab 1 所示,与Control组比较,LPS处理后的模型组细胞的iNOS表达量增加(P<0.01);与Model组比较,给药组细胞的iNOS表达量下降(P<0.01)。

3.4 CYA对LPS诱导的RAW264.7细胞COX-2表达的影响如Tab 1 所示,与Control组相比,LPS处理后的模型组细胞的COX-2表达量增加(P<0.01);与Model组相比,给药组细胞的COX-2表达量下降(P<0.05)。

4 讨论

RAW264.7细胞是小鼠体内的单核巨噬细胞,LPS可诱导巨噬细胞分泌多种炎症因子,如 NO、 iNOS、COX-2等,一般情况下iNOS和COX-2的表达量非常低,但它们却能够在炎症反应的诱导中被激活,从而引起炎症反应。iNOS和COX-2是调控炎症反应的关键因子,iNOS是NO合成的限速酶,主要对机体产生生物学效应,NO能促进炎症细胞因子COX-2的释放,而COX-2是炎症细胞加重炎症反应的关键酶[10]。实验结果表明,LPS诱导的RAW264.7细胞表达的iNOS和COX-2蛋白含量明显增加,给予不同浓度的 CYA处理,随着给药浓度的增加,这两种蛋白的含量逐渐降低,NO的含量也因此下降,从而有效的控制炎症反应的发生,这可能是CYA发挥抗炎机制的作用之一。综上所述,CYA可抑制RAW264.7细胞COX-2和iNOS蛋白在LPS诱导下的表达,这可能是CYA发挥抗炎作用的原因之一,但其具体的作用机制仍需进一步研究。