筋骨止痛凝胶化学成分分析

吕凯红 ，胡玉梅 ，钱梦雨 ，李 璐，刘文君 ，曹 亮，李吉峰，王振中，章晨峰，肖 伟*

（1.中国药科大学，江苏 南京 211198； 2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001； 3.中药制药过程控制与智能制造全国重点实验室，江苏 连云港 222001； 4.江苏康缘阳光药业有限公司，江苏 南京 210046）

筋骨止痛凝胶全方由醋延胡索、川芎、威灵仙、伸筋草、东北透骨草、路路通、海桐皮、防风、花椒、牛膝、薄荷脑、冰片共12 味药材组成，具有活血理气、祛风除湿、通络止痛的功效，临床上用于改善膝骨关节炎、肾虚、筋脉淤滞等症状。由于该方所含药材众多、成分复杂，其药效物质基础、作用机制尚不明确。目前化学成分研究方面，秦建平等［1］建立了高效液相色谱-质谱指纹图谱，指认了12 个共有峰； 王伟等［2］利用HPLC 测定了指标成分延胡索乙素和原阿片碱的含量； 刘莉莉等［3］利用GC 测定了挥发性成分冰片和薄荷脑的含量，但缺乏对复方非挥发性成分的全面分析。本研究采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS） 技术对筋骨止痛凝胶非挥发性成分进行快速分离和鉴定，并对其药材来源进行归属，以期全面建立筋骨止痛凝胶化学成分谱，为明确药效物质、阐明作用机制、提升质量控制水平提供依据。

1 材料

Agilent 1290 infinity 超高效液相色谱，联用Agilent 6538 Q-TOF 质谱仪，配置电喷雾离子源（ESI）、Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 软件（美国Agilent公司）； MIKRO 200 高速离心机（德国Andreas Hettich 公司）； Pacific T Ⅱ7 超纯水仪 （美国赛默飞公司）； KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Metller AL204 电子分析天平［梅特勒-托利多（上海） 有限公司］。

欧当归内酯A （批号111826-201806）、盐酸巴马汀（批号110732-201913）、苦参碱（批号110805-202010）、芦丁（批号 100080-202012）、路路通酸 （批号 111735-201903）、延胡索乙素（批号110726-202020）、升麻素苷（批号111522-201913）、金丝桃苷（批号111521-201507）、绿原酸 （批号110753-201817）、咖啡酸 （批号110885-201703）、补骨脂素 （批号110739-201918）、原阿片碱（批号 110853-201805）、盐酸黄连碱 （批号 112026-201802）、盐酸川芎嗪（批号110817-201608）、蛇床子素（批号110822-202111）、黄芩素（批号111595-201808）、盐酸小檗碱（批号110713-202015）、阿魏酸松柏酯（批号CHB201106）、β-蜕皮甾酮（批号111638-201706） 对照品均购自中国食品药品研究院； 洋川芎内酯H （批号B21462）、羟基-α-山椒素（批号B26430）、羟基-β-山椒素（批号B26431）、紫花前胡素（批号B50638）、四氢小檗碱（批号B21206）、洋川芎内酯Ⅰ（批号B21463） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司； 丁烯基苯酞 （批号CHB201122）、正丁基苯酞（批号CHB201116） 对照品购自成都克洛玛生物科技有限公司； 海罂粟碱（批号475-81-0）、东莨菪内酯（批号92-61-5） 对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司； 去氢延胡索甲素（批号21081004）、延胡索甲素（批号21092302） 对照品购自成都格利普生物科技有限公司； 脱氢海罂粟碱（批号CFN90406） 对照品购自武汉Chem Face 公司；E-藁本内酯（批号20191229） 对照品购自南京森贝伽生物科技有限公司。筋骨止痛凝胶（批号210101，江苏康缘阳光药业有限公司）； 处方药材购自主产区或道地产区，经江苏康缘药业股份有限公司王振中研究员鉴定，醋延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang.的干燥块茎； 川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎； 花椒为芸香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.的干燥成熟果皮；防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根； 牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根； 威灵仙为毛茛科植物威灵仙ClematischinensisOsbeck.的干燥根和根茎； 路路通为金缕梅科植物枫香树LiquidambarformosanaHance.的干燥成熟果序； 伸筋草为石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草； 东北透骨草为豆科野豌豆属植物山野豌豆ViciacraccaL.的干燥地上全草； 海桐皮为豆科乔木刺桐ErythrinavariegateL.var.orientalis（L.） Merr 的树皮。乙腈、甲酸均为色谱纯； 其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0～8 min，3% ～15% A； 8～20 min，15%A，20～30 min，15% ～30% A； 30～38 min，30% ～45% A；38～45 min，45% ～60% A； 45 ～48 min，60% ～95% A；48～50 min，95% ～3% A）； 体积流量0.35 mL/min； 柱温35 ℃； 进样量2 μL。

2.1.2 质谱 一级全扫描： 电喷雾离子源（ESI）； 正、负离子模式； 裂解电压135 V； 锥孔电压65 V； 干燥气氮气，温度350 ℃，体积流量8 L/min； 雾化气氮气，压力40 psi（1 psi ＝6.895 kPa）。二级扫描： 质量扫描范围m/z50 ～1 500； 碰撞气氮气，碰撞能量15 eV。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 取对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，使各成分质量浓度为20 μg/mL，14 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 称取筋骨止痛凝胶约1 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，超声处理30 min，放冷至室温，14 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 单味饮片溶液制备

2.2.3.1 花椒、川芎和防风单味饮片溶液制备 按照筋骨止痛凝胶生产工艺，分别取饮片20 g，加入10 倍量水回流提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，干燥，得干膏。取适量干膏，按 “2.2.1” 项下方法配制成20 mg/mL 的单味饮片溶液。

2.2.3.2 醋延胡索、伸筋草、东北透骨草、路路通、海桐皮、牛膝和威灵仙单味饮片溶液制备 按照筋骨止痛凝胶生产工艺，分别取饮片20 g，加入10 倍量70%乙醇提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至小体积，干燥，得干膏。取适量干膏，按“2.2.1” 项下方法配制成20 mg/mL 的单味饮片溶液。

3 结果

3.1 化学成分数据库的建立 查阅中英文相关文献，建立延胡索、川芎、威灵仙、伸筋草、东北透骨草、路路通、海桐皮、防风、花椒、牛膝10 味药材化合物数据库，包括化合物名称、结构、分子式、精确相对分子质量、特征碎片离子、所属化学类型等信息。

3.2 化合物鉴定 利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 技术，将供试品和对照品溶液在“2.1” 项条件下进样测定，得到正、负离子的总离子流图（TIC），见图1。正、负离子模式下一级质谱检测得到的精确相对分子质量，利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 软件生成的化合物分子式，选择误差在10 ppm 以内的分子式与建立的数据库进行匹配，推测出可能的化合物，进一步结合Auto MS/MS模式获得的相应化合物碎片离子信息与对照品和相关文献的比对进行化合物的鉴定。本研究共鉴定100 个化合物，其中28 个化合物经对照品比对确认，其中化合物2、4～8、10、14～22、28 ～29、32、38、41、44 ～48、50 ～51、53 ～54、56 ～58、60、63、75 ～76、78、91、95 均是含氮化合物； 3、42～43、77、79、80 ～81、83 ～85、97 ～100 均是苯酞类化合物； 23 ～24、26 ～27、30 ～31、33、35、39 ～40、49、52、55、59、61～62 均是黄酮类化合物； 64 和66 是香豆素类化合物； 65、67 ～74、82、86 ～90 是三萜皂苷类化合物； 1、9、11～13、25、34、36～37、92 ～94、96 是其他类化合物，结果见表1。

图1 筋骨止痛凝胶供试品TIC 图

表1 筋骨止痛凝胶中的化合物的UPLC-ESI-Q-TOF MS/MS 鉴定

3.3 筋骨止痛凝胶中化合物成分的质谱裂解规律解析

3.3.1 含氮类化合物 筋骨止痛凝胶中的含氮类化合物有生物碱类和酰胺类，生物碱类主要来源于醋延胡索、伸筋草。延胡索药材的生物碱成分大致可以分为4 个类型［30］，结构见图2。具体的二级裂解途径为四氢原小檗碱型生物碱（Ⅰ），A 和D 环的取代基最常见的是羟基、甲氧基和亚甲二氧基，此结构的C 环易发生逆狄尔斯-阿尔得（RDA） 反应，常见的特征碎片离子是m/z165.09，192.10，177.08，化合物32、45～46、50 均为Ⅰ类生物碱，以延胡索乙素（45） 为例，在正离子模式下，化合物45 在一级质谱中的准分子离子峰是m/z356.18 ［M＋H］＋，在二级质谱中，［M＋H］＋经过RDA 反应产生特征碎片离子m/z165.09 和m/z192.10，分别进一步丢失甲基，产生碎片离子m/z150.17，可能的裂解途径见图3； 原小檗碱型生物碱（Ⅱ），不会发生RDA 反应，8 位的H 易丢失，丢失CH4形成共轭体系，常见的特征碎片离子包括m/z322.09，323.11，324.12，336.12，化合物47、51、53、56 ～58、60均为Ⅱ类生物碱； 原阿片碱型生物碱（Ⅲ），会发生RDA反应，但是RDA 反应的碎片离子的质荷比加和不等于准分子离子峰的质荷比，一般相差一分子H2O，其典型碎片离子是m/z206.08，化合物38 为Ⅲ类生物碱； 阿朴啡型生物碱（Ⅳ），一般会产生相较于准分子离子峰31.04 Da 的碎片离子，m/z31.04 （NH2CH3） 是很典型的辨识阿朴啡型生物碱的标志。4 个类型的结构见图2。经与对照品比对，化合物38、41、45、48、50～51、53、57～58 分别确认为原阿片碱、脱氢海罂粟碱、延胡索乙素、海罂粟碱、四氢小檗碱、紫堇碱、巴马汀、小檗碱、去氢紫堇碱。

图2 4 种类型的延胡索生物碱

伸筋草中生物碱依据文献可大致分为2 种类型，含有1个N 原子的生物碱和含有2 个N 原子的生物碱，在筋骨止痛凝胶中检测到的化合物2、5～8、14、64 均为含有1 个N原子的生物碱； 化合物10、17～18 是含有2 个N 原子的生物碱，该类生物碱最常见的质谱裂解过程为与N 原子相连的甲基的裂解。以化合物10 为例，在正离子模式下，在一级质谱中的准分子离子峰是m/z261.19 ［M＋H］＋，在二级质谱中，［M＋H］＋丢失NH3后形成特征碎片m/z244.16 ［M＋H- NH3］＋，经对照品比对，确认为N-去甲基-α-玉柏碱（N-demethy-α-obscurine），可能的裂解途径见图4。

图4 N-去甲基-α-玉柏碱的二级质谱及可能的裂解途径

酰胺类化合物主要来源于花椒药材，在正离子模式下，化合物75～76、78 的酰氨基常裂解产生由于酰胺键断开而产生丢失氨基部分的m/z175.11 碎片离子。以化合物78 为例，其在一级质谱中的准分子离子峰是m/z264.19 ［M＋H］＋，在二级质谱中，［M＋H］＋丢失氨基部分而形成特征碎片m/z175.11 ［M＋H-C4H10NO］＋，失去一分子CO 碎片离子产生m/z147.11 ［M ＋H-C4H10NO-CO］＋，继续丢失碎片C3H4产生m/z107.08 ［M＋H-C4H10NO-CO-C3H4］＋。化合物78 经与对照品比对，确认为羟基-β-山椒素，其可能的裂解途径见图5。化合物75 ～76 经对照品比对，分别确认为羟基-ε-山椒素和羟基-α-山椒素。化合物91 依据碎片离子信息与文献比对，鉴定为α-山椒素［27］。

图5 羟基-β-山椒素的二级质谱及可能的裂解途径

3.3.2 苯酞类化合物 苯酞类化合物来源于川芎，苯酞类化合物裂解时最常见特征为内酯环开裂，含有不饱和侧链的化合物一般会丢失C2H5和CO 中性分子，化合物42～43、77、79、83 属于此类苯酞； 含有饱和侧链的化合物一般会丢失C4H9和CO 中性分子，侧链还常见丢失H2O 分子，化合物3、80～81 属于此类苯酞。化合物42 和43 是同分异构体，经对照品比对，分别为洋川芎内酯I 和洋川芎内酯H。化合物83～84 的出峰位置很接近，经对照品比对，分别确认为丁烯基苯酞和正丁基苯酞。

以化合物85 为例，在正离子模式下，一级质谱中准分子离子峰为m/z191.10 ［M＋H］＋，在二级质谱中，内酯环开裂失去一分子H2O，产生碎片离子m/z173.09 ［M＋HH2O］＋，失去一分子CO 碎片离子产生m/z145.10 ［M＋HH2O-CO］＋，继续丢失C2H4碎片离子m/z117.06 ［M ＋HH2O-CO- C2H4］＋，也会重排之后丢失C2H4而产生碎片离子m/z163.11 ［M＋H- C2H4］＋，化合物85 与对照品E-藁本内酯裂解途径一致，故确定为E-藁本内酯，其可能的裂解途径见图6。

图6 E-藁本内酯的二级质谱及可能的裂解途径

3.3.3 香豆素类化合物 香豆素类化合物主要来源于防风和花椒，其裂解时一般会丢失CO 和CO2碎片离子，这是因为此途径有形成更稳定的共轭结构的趋势。化合物64 为呋喃香豆素类，化合物66 为简单香豆素类，两者均会丢失CO 碎片离子。在正离子模式下，化合物64 在一级质谱中的准分子离子峰是m/z217.04 ［M＋H］＋，在二级质谱中，［M＋H］＋丢失一分子CH3形成特征碎片离子m/z202.02 ［M＋H- CH3］＋，丢失一分子CO 形成特征碎片离子m/z174.02［M＋H-CH3-CO］＋，继续丢失两分子CO 形成特征碎片m/z146.03 ［M＋H-CH3-2CO］＋，故确认为花椒毒素，其可能的裂解途径见图7； 化合物66 在正离子模式下的准分子离子峰为m/z193.12 ［M＋H］＋，二级碎片离子m/z178.02 ［M＋H-CH3］＋、137.06 ［M＋H-2CO］＋和m/z122.96 ［M＋H-2COCH3］＋，因此推断为东莨菪素。

图7 花椒毒素的二级质谱及可能的裂解途径

3.3.4 黄酮类化合物 黄酮类化合物主要来源于防风、花椒和东北透骨草。黄酮类化合物以2-苯基色圆酮为母核，其二级质谱常发生糖苷键断裂，形成苷元离子。黄酮及其苷类化合物C 环易发生RDA 裂解反应，以及不饱和C 环丢失一分子CO 成五元环，一些苷元会脱H2O、CH3以及C4H4O2碎片。以金丝桃苷（31） 为例，在负离子模式下，峰31 在一级质谱中的准分子离子峰是m/z463.09 ［M-H］-，在二级质谱中，［M-H］-丢失葡萄糖基，产生了特征碎片m/z300.02 ［M-H-Glc］-，继续丢失一分子CO 形成特征碎片m/z271.02 ［M-H-Glc-CO］-； ［M-H］-也可能经过RDA反应产生特征碎片m/z151.00 和m/z313.08，化合物31 与对照品金丝桃苷的裂解途径一致，因此将峰31 确认为金丝桃苷，其可能的裂解过程见图8。化合物23、24、31 经与对照品和文献［13，29-30］ 比对，分别确认为芦丁、升麻素苷、金丝桃苷。

图8 金丝桃苷的二级质谱及可能的裂解途径

3.3.5 三萜皂苷类化合物 三萜皂苷类化合物主要来源于牛膝和威灵仙，三萜皂苷类化合物一般是皂苷的糖苷键发生断裂。皂苷所连糖基有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等，依据丢失的质荷比可以判断糖基的类型。牛膝皂苷和威灵仙皂苷的苷元均为齐墩果酸母核。以chikusetsusaponin Ⅳ（70） 为例，化合物70 在一级质谱中的准分子离子峰m/z925.48 ［M-H］-，在二级质谱中，先丢失1 分子阿拉伯糖基产生碎片离子m/z793.43 ［M-H-Ara］-，丢失葡萄糖基产生碎片离子m/z631.39 ［M-H-Ara-Glu］-，推断化合物70 是chikusetsusaponin Ⅳ［16］，其可能的裂解途径见图9。根据以上裂解规律，峰65、67～69、71 ～74、82、86 ～90，分别确认为clematichinenoside C、huzhangoside B、pen-rha-pen-oleglc-glc、ginsenosideRo、chikusetsusaponinⅣa、achyranthoside C、achyranthoside E、achyranthoside B or bidentatoside I、zingibroside R1、achyranthoside Ⅳ、28-deglucosyl-achyrantho-side C、28-deglucosylchikusetsusa-poninⅣ、28-deglucosychikusetsusa-ponin Ⅳ a、28-deglucosylachyrantho-side E。

图9 chikusetsusaponin Ⅳ的二级质谱及可能的裂解途径

4 讨论

为获得较好的分离，本实验前期考察了流动相，包括0.8%甲酸（含有0.1% 甲酸铵） -乙腈、0.1% 甲酸-甲醇、0.1%三乙胺-乙腈、0.1%甲酸-乙腈等，采用不同梯度进行洗脱，最终确定0.1% 甲酸-乙腈梯度洗脱条件下各成分分离度良好，出峰数目较多。

本实验通过保留时间、准分子离子峰、二级碎片离子信息对各个色谱峰进行了归属，共鉴别100 个化合物，28个化合物经对照品比对得到确认，并推测了含氮类、苯酞类、香豆素类、黄酮类和三萜皂苷类化合物的质谱裂解规律，化合物主要来源于延胡索、川芎、威灵仙，东北透骨草、路路通、海桐皮、防风、花椒，未鉴定出薄荷脑和来源于冰片的化合物，因为薄荷脑和冰片中的化合物为挥发性成分，后期需进一步采用GC-MS 对挥发性成分进行鉴别，完善了筋骨止痛凝胶的物质基础信息。

本研究结果表明筋骨止痛凝胶主要化学成分为生物碱类、苯酞类、黄酮类和三萜皂苷类，主要来自于延胡索、川芎、海桐皮、花椒等，明确了这些药味在方中的贡献，为后续质量标准提升和阐明药效物质基础提供了参考。