重楼皂苷Ⅰ凝结HepG2 细胞膜胆固醇增加阿霉素敏感性的研究

江 旻，陈李霞，洪 超，张立涓，路 璐，康 萍，赵文军，丁 越，张 彤

（上海中医药大学，上海 201203）

胆固醇是细胞膜的必要组成成分之一［1］，其能影响细胞膜脂区的形成及膜蛋白的结构和功能［2］。胆固醇和脂质间的相互作用促进细胞膜上微结构域的形成，其中包括脂筏和膜微囊［3-4］。细胞膜上胆固醇的增加有助于脂筏的扩增，对脂区的功能及膜蛋白的表达有重要的影响，并可进一步改变细胞膜的通透性、流动性和韧性等［5-6］，调节参与肿瘤发生和癌症进展的信号通路。研究证实，在对肿瘤细胞进行化疗药物治疗过程时，异常聚集的胆固醇会降低细胞膜通透性［7］，减少药物摄取，提高ABC 转运蛋白水平［8］，增加药物外排来抵抗化疗药物的治疗敏感性。

重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，有清热解毒、消肿止痛之功效［9］。其中重楼皂苷Ⅰ为主要抗肿瘤活性成分，研究证明其对肝癌［10］、肺癌［11］、乳腺癌［12］等多种癌症有较好的抑制作用。同时，有报道称重楼皂苷Ⅰ可增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性，如Song 等［13］研究发现重楼皂苷Ⅰ可增加HepG2 细胞对顺铂的敏感性；Zhu 等［14］研究发现重楼皂苷Ⅰ可增加MCF-7 细胞对盐酸阿霉素的敏感性，以上研究表明重楼皂苷Ⅰ具有良好的改善化疗药物敏感性逆转耐药的前景，但其具体作用机制尚不明确。本研究将阐明重楼皂苷Ⅰ基于对细胞膜胆固醇的凝结作用，及其提高化疗药物敏感性的作用机制，以期为重楼皂苷Ⅰ抗肿瘤机制提供新的理论依据。

1 材料

1.1 细胞株 人肝癌细胞株HepG2 （编号SCSP-510），购于中国科学院干细胞库，将HepG2 细胞加入含有10%FBS、100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 链霉素的MEM 培养基中，在37 ℃、5% CO2环境中培养。

1.2 药物与试剂 重楼皂苷Ⅰ对照品、盐酸阿霉素（doxorubicin hydrochloride，DOX） （上海源叶生物科技有限公司，批号 M29N11S132593、A25GS158731）。胆固醇（cholesterol，Chol） 对照品（上海艾韦特医药科技有限公司，批号B71154）； 总胆固醇检测试剂盒（南京建成科技有限公司，批号20201128）； FillipinⅢ（美国MedChemExpress 公司，批号0604116）； 鬼笔环肽、Anti-ABCA1 抗体［艾博抗（上海） 贸易有限公司，批号GR3370348-1、GR3316971-7］； CTB-488 （美国赛默飞世尔科技公司，批号2291509）；增强型CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号031521211228）； DAPI 染色液（合肥白鲨生物科技有限公司，批号70120050）。

1.3 仪器 高效液相色谱仪（型号Agilent1100，美国安捷伦公司）； 激光共聚焦显微镜（型号CLSM，德国Leica 公司）； 多功能酶标仪（型号SpectraMax iD5，美国BioTek 公司）； 细胞流式仪（型号CytoFLEX，美国贝克曼库尔特公司）； 电子透射电镜（型号JEM-1230，日本JEOL 公司）；超净工作台（型号DL-CJ-IND-Ⅱ，北京东联哈尔仪器制造有限公司）； CO2细胞培养箱 （型号Forma 3100，美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 体外结合实验 称取重楼皂苷Ⅰ对照品1 mg 加入甲醇1 mL，配制成1 mg/mL 的溶液； 称取胆固醇对照品100 mg 加入氯仿1 mL，配制成100 mg/mL 的溶液，备用。根据胆固醇、重楼皂苷Ⅰ摩尔比5 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶5，取200 μL 重楼皂苷Ⅰ溶液，加入5 μL 胆固醇溶液，充分混匀后，室温下摇床振摇2 h，然后，8 000 r/min 离心5 min，取上清液检测粒径； 并采用高效液相色谱法检测上清液中剩余重楼皂苷Ⅰ的含量，通过计算得到不同比例下重楼皂苷Ⅰ与胆固醇的结合率。

2.2 HepG2 细胞总胆固醇含量检测 取对数生长期HepG2细胞混悬液2 mL，分别置于6 孔培养板中，每孔约1×106个，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分别加入重楼皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L）、洛伐他汀（2 μmol/L）、胆固醇（5 μmol/L），继续培养24 h。弃去含药培养基，用含EDTA 胰酶消化后，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，留细胞沉淀，用等渗缓冲液PBS 清洗1～2 次，1 000 r/min 离心10 min，细胞沉淀用PBS 重悬。取细胞重悬液2 μL 加入96 孔板中，加入200 μL 总胆固醇工作液，37 ℃孵育10 min，于510 nm 波长处检测光密度（OD） 值。根据公式胆固醇量＝ （OD样本-OD空白） / （OD校准-OD空白） ×校准品浓度，计算细胞中胆固醇含量。

2.3 Filipin Ⅲ试剂检测细胞内总胆固醇变化 将培养好的HepG2 细胞铺于激光共聚焦培养皿，每孔2×104个，培养24 h 后，加入重楼皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L） 孵育24 h。弃去含药培养基，用PBS 清洗2 ～3 次，加入鬼笔环肽抗体（1 ∶1 000） 孵育1 h，然后加入Filipin Ⅲ抗体（1 ∶1 000）孵育1 h，弃去含药培养基，加入500 μL PBS，于激光共聚焦显微镜下观察。

2.4 透射电镜观察HepG2 细胞膜结构 将HepG2 细胞以每孔4×105个的密度接种于培养皿中，培养24 h 后，用不同浓度重楼皂苷Ⅰ（2、4、8 μmol/L） 处理24 h。用0.1 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液清洗细胞，1.5%戊二醛4 ℃固定2 h，再清洗3 次，1%四氧化锇固定1 h，清洗2 次，用不同体积分数的乙醇（30% ～100%） 和100% 环氧丙烷脱水制备。将细胞浸润并嵌入Agar-100 树脂中，60 ℃加热过夜硬化。制备超薄切片，并使用JeolJEM-1230 透射电子显微镜观察细胞膜结构并获取图像［15］。

2.5 CTB-488 检测细胞膜脂筏含量变化 将HepG2 细胞接种到激光共聚焦皿上，培养24 h 后，加入重楼皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L） 孵育24 h，弃去原有培养基，每孔加入1 mL AF488-CTB （5 μg/mL），并将6 孔板置于冰上孵育20 min 以完成CTB-488 对细胞膜脂筏的标记。用灭菌PBS 清洗2 ～3次后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，再用灭菌PBS 清洗2～3次，于激光共聚焦显微镜下分别观察各组荧光强弱情况。

2.6 免疫荧光染色检测细胞膜脂筏及ABCA1 蛋白表达变化 将HepG2 细胞接种到激光共聚焦皿上，培养24 h 后，分为对照组、DOX 组（1 μmol/L）、DOX （1 μmol/L） ＋重楼皂苷Ⅰ （2 μmol/L） 组及Chol （5 μmol/L） ＋DOX（1 μmol/L） ＋重楼皂苷Ⅰ（2 μmol/L） 组，加入相应药物于培养箱中培养24 h，弃去含药培养基，用灭菌PBS 清洗2～3 次，每皿加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定10 min，加入0.5%Triton-100X 溶液透化细胞5 min，2%BSA 溶液封闭30 min，加入anti-ABCA1 一抗4 ℃孵育过夜，第二天回收一抗，加入Alex647-荧光二抗室温孵育1 h，回收二抗，用PBS 清洗2～3 次。AF488-CTB 染色方法同上。于激光共聚焦显微镜下分别观察各组荧光强弱情况。

2.7 Western blot 法检测细胞膜ABCA1 蛋白表达 取对数生长期HepG2 细胞混悬液1 mL，接种于6 孔培养板中培养24 h，分别加入1 mL 不同浓度重楼皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L）和DOX （2 μmol/L） 继续培养48 h，弃去含药培养基，用细胞刮刀收集细胞，冷PBS 洗涤2 次，收集至1 mL 离心管中，3 000 r/min 离心5 min，弃去上清，加入细胞裂解液和PMSF 混合液（100 ∶1） 100 μL，吹打均匀，冰上放置30 min 后，4 ℃、15 000 r/min 离心10 min，取上清液10 μL，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，剩余上清液加入1/5 总体积loading buffer，100 ℃加热10 min，取出后于-20 ℃保存。通过常规Western blot 法检测蛋白表达。

2.8 DOX 的吸收作用

2.8.1 激光共聚焦显微镜检测 将HepG2 细胞接种于共聚焦培养皿中，培养24 h 后，分别给予重楼皂苷Ⅰ（2 μmol/L） 及游离胆固醇 （5 μmol/L） ＋重楼皂苷Ⅰ （2 μmol/L），孵育3 h，去除含药培养基，PBS 清洗3 次，加入含DOX （1 μmol/L） 的培养基，孵育3 h，去除培养基，PBS 清洗3 次，加入不含血清培养基，于激光共聚焦显微镜下观察DOX 荧光强弱。

2.8.2 细胞流式仪检测 取对数生长期HepG2 细胞混悬液1 mL 接种于6 孔板中，培养24 h，分别给予重楼皂苷Ⅰ（2 μmol/L） 及游离胆固醇（5 μmol/L） ＋重楼皂苷Ⅰ（2 μmol/L），37 ℃孵育4 h，去除含药培养基，PBS 清洗3次，加入含DOX （1 μmol/L） 的培养基，37 ℃孵育3 h，胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清，PBS 清洗3次，加入1 mL PBS 重悬，转移至流式管中，上机进行流式检测。

2.9 CCK-8 法检测细胞毒性 取对数生长期HepG2 细胞混悬液100 μL （约每孔1×104个细胞），接种于无菌96 孔培养板中，培养24 h 后，每孔分别加入100 μL 不同浓度的重楼皂苷Ⅰ、DOX 及DOX＋重楼皂苷Ⅰ组，另外再设Chol＋重楼皂苷Ⅰ组及Chol＋DOX＋重楼皂苷Ⅰ组（均加游离胆固醇5 μmol/L），继续培养48 h，弃去含药培养基，加入10 μL CCK-8 试剂及100 μL 无血清MEM 培养基，置于培养箱避光孵育1 h，在450 nm 波长处用酶标仪测定吸光度（A）值，并计算细胞存活率和IC50值，公式为细胞存活率＝（A样品-A空白） / （A对照-A空白） ×100%。

2.10 统计学分析 通过SPSS 18.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 重楼皂苷Ⅰ与胆固醇的体外结合反应 如表1、图1A所示，在胆固醇、重楼皂苷Ⅰ为5 ∶1 的摩尔比下，上清液中几乎检测不到重楼皂苷Ⅰ成分，溶液中粒径较小，表明重楼皂苷Ⅰ与胆固醇充分结合； 而随着重楼皂苷Ⅰ的比重增加，结合率也逐步下降，溶液中粒径增大，游离重楼皂苷Ⅰ含量增加，表明在胆固醇和重楼皂苷Ⅰ的不同摩尔比下，重楼皂苷Ⅰ可随着胆固醇的含量增加与胆固醇充分结合，而胆固醇含量减少则结合反应减弱。同时，本研究还发现，重楼皂苷Ⅰ可与胆固醇形成凝胶状固态物，见图1B，推测其可能为两者发生氢键结合反应形成非共价键的水凝胶分子，为两者的结合反应提供进一步的佐证。

图1 重楼皂苷Ⅰ与胆固醇的体外结合反应

表1 重楼皂苷Ⅰ与胆固醇体外结合后上清液中成分粒径信息

3.2 重楼皂苷Ⅰ对HepG2 细胞膜胆固醇含量的影响 如图2A 所示，重楼皂苷Ⅰ可有效降低细胞的总胆固醇含量（P＜0.05，P＜0.01），且与阳性药物洛伐他汀（Lovastatin，Lova） 作用相当，且高浓度药效更为显著。如图2B 所示，通过Filipin Ⅲ标记定位HepG2 细胞胆固醇分布，显示绿色荧光即为与胆固醇结合的Filipin Ⅲ，红色荧光即为与鬼笔环肽（Phalloidin） 结合的细胞膜骨架结构。对照组HepG2细胞膜上绿色荧光强度较强，细胞内分布较弱； 在重楼皂苷Ⅰ的作用下，细胞膜上的绿色荧光减弱，红色荧光强度不变，浓度越大效果越明显，表明重楼皂苷Ⅰ可使细胞膜上胆固醇含量明显减少。

图2 重楼皂苷Ⅰ对HepG2 细胞膜胆固醇含量的影响（±s，n＝3）

3.3 重楼皂苷Ⅰ对HepG2 细胞膜形态的影响 如图3 所示，对照组HepG2 细胞表面膜质非常光滑，且外层有许多微绒毛，线粒体及内质网结构正常； 不同浓度重楼皂苷Ⅰ组细胞膜形态学发生改变，表面凹凸不平且随着浓度的增加有不同程度的膜断裂现象（如红色箭头所示），微绒毛脱落并在膜外形成特化结构，内质网肿胀及线粒体凋亡，表明在重楼皂苷Ⅰ的作用下，细胞膜通透性发生改变，降低了物质进出细胞的抵抗力，促进了化疗药物的渗透作用。

图3 重楼皂苷Ⅰ对HepG2 细胞膜形态的影响

3.4 重楼皂苷Ⅰ对细胞膜脂筏及ABCA1 表达的影响 如图4所示，绿色荧光为CTB-488 标记的细胞膜脂筏，红色荧光为抗体标记的ABCA1 蛋白，蓝色荧光为DAPI 标记的细胞核。DOX 组细胞膜脂筏及ABCA1 蛋白荧光强度无明显变化，与对照组相似； DOX＋重楼皂苷Ⅰ组绿色及红色荧光强度明显减弱，表明重楼皂苷Ⅰ可结合细胞膜上胆固醇，从而降低膜上胆固醇含量，进一步影响细胞膜脂筏的形成及功能，在降低膜上脂筏含量的同时，能进一步影响到ABCA1 蛋白表达，对增加DOX 的敏感性具有一定积极意义； 而加入游离胆固醇后，重楼皂苷Ⅰ的作用被明显抑制，脂筏及ABCA1 的荧光强度都有不同程度的恢复，推测重楼皂苷Ⅰ对细胞膜脂筏及ABCA1 的作用与细胞膜胆固醇含量密切相关。

图4 重楼皂苷Ⅰ对细胞膜脂筏及ABCA1 表达的影响

3.5 重楼皂苷Ⅰ对细胞膜ABCA1 蛋白表达的影响 如图5所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅰ组ABCA1 蛋白表达降低（P＜0.05），且化疗药物DOX 无明显作用（P＞0.05），表明重楼皂苷Ⅰ可有效降低ABCA1 蛋白在细胞膜上的表达，从而抑制药物的外排作用。

图5 重楼皂苷Ⅰ对细胞膜ABCA1 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

3.6 重楼皂苷Ⅰ对化疗药物DOX 在HepG2 细胞中吸收的影响 DOX 自带荧光表现为红色荧光。如图6 所示，在单独给予DOX 时，HepG2 细胞内红色荧光强度较弱，表明肿瘤细胞对DOX 的吸收较差； 但在重楼皂苷Ⅰ作用下，HepG2 细胞内红色荧光增强，表明DOX 含量增加，重楼皂苷Ⅰ可起到促进DOX 吸收的作用，从而增加DOX 的疗效。然而，在联合用药组中加入游离胆固醇后，DOX 吸收增加的作用被抑制，表明游离胆固醇可竞争性地与重楼皂苷Ⅰ结合从而抑制重楼皂苷Ⅰ对细胞膜胆固醇的作用，进而影响DOX 的吸收。

图6 重楼皂苷Ⅰ对DOX 在HepG2 细胞中吸收的影响（±s，n＝3）

3.7 重楼皂苷Ⅰ对化疗药物DOX 在HepG2 细胞中敏感性的影响 如表2、图7 所示，DOX 单药的IC50值为（0.77±0.12） μmol/L，在DOX 中加入重楼皂苷Ⅰ后，DOX 的抗肿瘤活性提升，IC50值下降为（0.32±0.095） μmol/L，表明重楼皂苷Ⅰ可增加HepG2 对DOX 的敏感性。然而，在重楼皂苷Ⅰ及DOX＋重楼皂苷Ⅰ的联合给药组别中加入游离胆固醇后，重楼皂苷Ⅰ及联合给药组的细胞抑制率降低，表明重楼皂苷Ⅰ对DOX 的增敏作用与细胞膜胆固醇密切相关。

图7 重楼皂苷Ⅰ对DOX 在HepG2 细胞中敏感性的影响

表2 各组药物的IC50值

4 讨论

肝癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，位居恶性肿瘤发病谱的第6 位，死亡谱的第4 位［16］。2018 年，我国肝癌新发病例数占全球46.6%，死亡病例数占全球47.1%［17］。我国作为肝癌高发国家，中晚期肝癌患者比例高，肝癌的高复发率和转移率以及耐药问题使其防控形势异常严峻。目前，采用中西医联合治疗肝癌在临床上取得了较好的效果，特别是在增加化疗药物疗效和提高敏感性方面有一定优势。

目前，中药活性成分在临床肿瘤防治中越发重要，甾体皂苷作为中药和天然药物中一类重要的生物活性物质，大多存在于单子叶植物的百合科、石蒜科和薯蓣科等植物中，包括中药知母、天冬、重楼等。甾体皂苷具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、降血脂、抗炎和调节免疫等作用［18］。重楼皂苷Ⅰ针对多种肿瘤细胞都具有良好抗肿瘤药效，同时研究也表明其可增加各类化疗药物敏感性，提升化疗药物疗效。基于课题组前期对重楼皂苷Ⅰ降低肿瘤胆固醇含量的研究，及相关研究证实细胞膜上胆固醇降低可影响脂筏的形成及聚集，起到抗肿瘤以及逆转耐药等相关作用［19］。表明重楼皂苷Ⅰ具有良好的改善化疗药物敏感性，逆转肿瘤细胞耐药的前景，但其具体机制尚不明确，有待进一步研究。

脂筏为细胞质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域。其中，胆固醇为促进脂筏形成的重要原料，去除细胞膜上胆固醇可改变与脂筏结合的膜成分的分布或功能［20］。脂筏在细胞膜表面可结合不同种类的蛋白如胆固醇结合蛋白及跨膜蛋白等，广泛参与了细胞信号传导及物质转运等细胞事件。ABCA1 蛋白为细胞膜上ABC 转运家族蛋白之一，它在促进胆固醇外流出细胞进而启动逆向转运的起始阶段发挥重要的作用［21］。本实验基于重楼皂苷Ⅰ与胆固醇的结合作用，发现其在体外可与胆固醇结合形成凝胶固态物，进一步探究了重楼皂苷Ⅰ对HepG2 细胞膜胆固醇的影响，发现其可通过与膜胆固醇形成复合物。重楼皂苷Ⅰ不仅增强了质膜的流动性和通透性，而且破坏了细胞膜上脂筏的分布，进一步抑制了ABC 转运蛋白的表达和功能，使更多的DOX 到达细胞质或细胞核并增加对肿瘤细胞的敏感性。该结果为中药活性成分与化疗药物联合使用提供了新的研究思路，并为重楼皂苷Ⅰ的抗肿瘤机制提供了新的理论和实验基础。