基于啮齿类动物模型的推拿治疗神经病理性疼痛机制研究进展

吴丽萍 唐宏亮 梁英业 王开龙 庞军

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)在人群中的患病率高达7%～10%,占慢性疼痛患者的20%～25%[1]。NP主要由神经压迫、离子通道病、自身免疫性疾病和组织创伤等导致上行疼痛通路和下行抑制通路之间的失衡引起[2]。其包括外周神经系统中带状疱疹神经痛、三叉神经痛、疼痛性多发性神经病、多发性硬化症的中枢性疼痛等[3]。尽管对NP的研究取得了进展,但对NP诱导和维持机制的不完全理解,NP发病率仍持续上升,目前也无确切有效的治疗方法和药物,严重影响患者的生活质量,甚至危及生命,给全球卫生和社会保障体系带来了沉重的负担,因此需要迫切寻求NP的安全可靠的治疗方法。

1 NP啮齿类动物模型的选择和构建

在临床研究前推拿对NP的机械性超敏反应、突触可塑性改变、自主神经功能障碍的研究,大部分是用啮齿类动物进行的。研究和治疗NP的一个主要问题是其高度可变的病因,即从脑部病变到脊髓脱髓鞘疾病,以及糖尿病或抗癌化疗引起的周围神经病变。由于NP具有多种病因,不同的NP动物模型被创造出来。这些模型主要包括中枢神经系统疼痛模型、外周神经系统疼痛模型、药物诱导的神经病变模型以及疾病诱导的神经病变模型[4]。

在推拿治疗啮齿类动物NP的研究中,所采用的模型主要以结扎介导的周围神经损伤为主,即坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury, CCI)和脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)模型。CCI模型用于自发性疼痛、异常感觉、卡压性神经病变相关的感觉症状[5]。它在股骨中段以下通过3或4根铬制肠线结扎单侧坐骨神经,每根间距约0.5或1 mm,术后一周内即痛觉行为学改变,术后第二周内出现最大疼痛相关行为和姿势不对称疼痛体,体征持续时间超过2个月[6]。然而,当需要较大且稳定的疼痛行为幅度时,SNL模型成为首选模型。它通过结扎背根神经节远端L5脊神经所构建。该模型机械性痛觉超敏、热痛觉过敏和自发性疼痛等行为学改变在24～48小时内发生,并至少持续3～4个月[7]。

上述两种模型都是由A纤维和C纤维的异位放电增加来启动和维持疼痛。在推拿治疗啮齿类动物NP方面,对热或机械刺激的行为反应通常被用作疼痛体验的替代[8]。具体来说,热或机械刺激引起的反射撤退阈值是作为鼠类疼痛阈值的一个指标。但由于鼠类的品系、缝合材料及缝合线结扎所产生的收缩紧密度的变化使这些结果存在一定的差异,因此临床前模型中对NP的评估存在重大挑战。近年,条件性位置偏爱、回避提供的内部奖赏及厌恶感知的外部测量被建议作为持续疼痛样行为的指标[9]。这些指标是否能作为推拿治疗NP的疗效评估,尚需进一步研究。尽管如此,CCI和SNL作为有希望的模型,为NP机制研究提供了基础,同时为推拿镇痛机制的研究提供了巨大的潜力。

2 抑制星型胶质细胞和M1型小胶质细胞的活化

胶质细胞包括小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺细胞的激活能够诱导NP的中枢和外周敏化[10]。在脊髓,以小胶质细胞和星形胶质细胞为代表的神经胶质细胞与神经损伤诱发的疼痛关系密切。研究发现在SNL小鼠模型中miR-186-5p和趋化因子CXC配体13/CXC趋化因子受体5介导星形胶质细胞激活以促进NP发展[11]。脊髓小胶质细胞活化主要发生在炎症或神经损伤的早期阶段,在痛觉敏化的发生过程中发挥重要作用。而星形胶质细胞激活常发生在小胶质细胞激活之后,其表达水平与疼痛行为密切相关,主要参与慢性痛的维持[12]。

在周围神经损伤后,小胶质细胞会降解脊髓背角I层中的细胞外基质结构,即神经元周围网,薄板I PNN选择性地包裹棘臂旁投射神经元,这些神经元整合脊髓中的伤害性信息并将其传递到脊髓上脑区域并诱发疼痛感[13]。因此,小胶质细胞和星型胶质细胞的激活与NP感觉神经元的刺激激活有关。

吴志伟等[14]发现在大鼠CCI后脊髓背角中星形胶质细胞和M1型小胶质细胞被活化,膜蛋白CD68做为小胶质细胞标志物,其含量在CCI术后高于同时期的空白组及假手术组,经推拿按揉法干预后,CD68含量降低,并伴随长C纤维诱发的场电位下调和脊髓背角时程增强抑制,减弱突触强化引起的中枢敏化,调节NP的发生发展。这些结果表明推拿能够通过小胶质细胞改变突触重塑、连接和网络功能。但推拿不能逆转CCI后造成的M1型小胶质细胞活化,这可能与推拿作为一种柔和舒适、具有压力、温度等复合特性的刺激方法通过相应感受器传递并调整机体免疫系统有关。

上述结果表明,星型胶质细胞和M1型小胶质细胞的活化可能对神经突触恢复有影响,推拿可能是影响NP后突触重塑的潜在策略。然而相关研究较少,推拿与NP后星形胶质和小胶质细胞的关系仍需进一步探讨。

3 抑制p38丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶激活

p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的激活参与NP[15]。其中p38 MAPK是炎症过程中表征最好的激酶之一,由4个亚基:p38α,p38β,p38γ和p38δ组成。它们在调节哺乳动物细胞的细胞内信号转导方面起着积极的作用[16]。p38 MAPK诱导NP和其他慢性疼痛相关的各种细胞内反应。因此,特异性靶向p38 MAPK分子及其信号通路代表了疼痛管理的潜在治疗策略[17]。

ERK 1/2是丝裂原活化蛋白激酶超家族的成员,通过外周组织暴露于有害刺激而在神经元中激活的分子。周围神经损伤在不同的时间点诱导神经胶质细胞、感觉神经元和二阶神经元中的ERK激活[18]。红核白介素(interleakin,IL)-33通过激活ERK、p38 MAPK和JAK2/STAT3,在保留性神经损伤(spared nerve injury,SNI)模型诱导的单神经病性疼痛的早期发展中产生痛觉作用,相应的抑制剂显着减轻SNI诱导的单神经病理性疼痛或IL-33诱发的机械超敏反应[19]。

韦斌丽[20]在NP-CCI大鼠模型脊髓背角中发现CCI组大鼠的ERK、p38 MAPK蛋白表达均高于正常组和假手术组, 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)低于正常组和假手术组,而经“环跳”“风市”及“阳陵泉”穴推拿干预后,大鼠热痛阈值及机械缩足反射阈值升高,推拿组的ERK、p38 MAPK蛋白表达均低于CCI组和假推拿组,MKP-1高于CCI组和假推拿组。他们还发现推拿镇痛的机制可能介导ERK、p38 MAPK激活MAPK信号通路中ERK基因和蛋白的表达,抑制下游炎性因子IL-1β的表达有关。以上研究表明ERK信号通路参与了NP过程,推拿能够抑制蛋白激酶ERK及p38 MAPK激活依赖的神经炎症,这可能为NP控制提供一种新的治疗策略。

4 调控脊髓背角Ca2 +离子通道

传入感觉神经元中疼痛刺激的检测和处理严重依赖于各种不同类型的电压和配体门控离子通道,包括钠、钙和TRP通道等,这些通道的功能包括检测机械和化学损伤、产生动作电位和调节神经元放电模式、启动背角突触处的神经递质释放、以及激活投射到大脑疼痛中心的脊髓神经元[21-22]。离子通道表达和功能的持续变化会导致慢性疼痛状态。

尽管多岩石地带的地形崎岖陡峭，空气寒冷、干燥，但仍有很多哺乳动物在此安家。为了生存，它们必须适应环境。有些动物长着厚厚的皮毛以保暖过冬，有些动物则上上下下地来回迁移，以躲避糟糕的天气。

高压激活Ca2+通道在神经系统中广泛表达,它们通过参与突触传递、突触可塑性的变化和神经元兴奋性在疼痛传导中发挥重要作用。现有证据表明,高压激活Ca2+通道是疼痛管理的重要治疗靶点[23]。此外,研究发现编码钠钙交换剂3型在小鼠背角神经元中表达,缺乏该基因的小鼠背角神经元在重复刺激后,显示细胞内钙增加、钙清除减慢和发束增加,小鼠出现急性疼痛行为[24]。传入疼痛通路中涉及的许多通道对钙离子具有渗透性,这表明钙离子在细胞信号传导中的作用超出了单纯的电活动的产生[25]。

Wang等[26]在CCI模型大鼠的背根神经节中检测到65个受推拿调节的差异表达基因,他们用KEGG分析了推拿的潜在即时镇痛机制最终发现推拿的即时镇痛机制与钙信号通路有关。1次推拿给予机体的机械刺激可启动CCI大鼠脊髓背角中钙号通路,通过Ca2 +的摄取和释放来调节细胞内Ca2 +浓度,降低损伤敏感神经元的超兴奋性,从而修复损伤的神经元细胞,减轻局部炎性微环境诱导的伤害性超敏反应;同时推拿通过细胞中产热或调节脂解的表达和蛋白-1的解偶联介导含能化学物质的耗散,调控棕色脂肪组织诱导适应性产热,进而与β肾上腺素能受体结合,增加脂肪分解,在基因水平调节神经损伤局部能量代谢从而减轻痛觉过敏,抑制CCI诱导NP的发生发展[26]。

总之,以上研究表明在CCI诱导Ca2 +转运和损伤敏感神经元的超兴奋性存在紧密的相互作用,推拿能够调节钙信号通路抑制疼痛的形成和维持。当然,研究背根神经节创伤如何调节钙信号通路的激活从而介导NP的发生将是非常有意义的。

5 减少促炎因子及炎症介质分泌

肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等多种免疫细胞在外周和中枢致敏中发挥重要作用,包括突出的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、IL-1β、IL-18、IL-6以及γ干扰素[27]。此外还有炎症介质前列腺素E2、囊泡谷氨酸转运蛋白、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体 、Toll样受体4与NP进展密切相关[28-29]。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)促进原代感觉神经元中疼痛介质的合成[30],而运用调和冲任推拿能抑制患者血清PGE2因子的表达[31]。除此,本文将重点介绍推拿治疗啮齿类神经病理性疼痛高度相关的一些最新发现。

5.1 降低脊髓背角囊泡谷氨酸转运蛋白2表达

囊泡谷氨酸转运蛋白2(vesicular glutamate transporters2,VGLUT2)控制谷氨酸的储存和释放,谷氨酸在中枢疼痛处理中起着关键作用。在SNI诱导脊髓损伤中VGLUT2表达的上调,并且在手术前后鞘内给予针对VGLUT2的shRNA减轻了机械异常性疼痛和病理性增强的谷氨酸释放[32]。

王雄将在SNL模型中发现与空白组比较,假手术对照组大鼠的VGLUT2表达水平在造模后出现一过性的增高,神经病理性行为增加,而IL-6、TNF-α水平显著升高,而推拿组大鼠经过干预后,脊髓背角的VGLUT2和血清中的 IL-6、TNF-α水平均显著下降[33]。这进一步说明VGLUT2与脊髓损伤和中枢敏感的痛觉信号传递之间存在着强烈的关联性。

5.2 抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体活化

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎症小体是先天免疫系统的关键组成部分,其在慢性疼痛条件下失调,并有助于慢性疼痛的发病机制[34],有研究发现miR-23a直接靶向趋化因子受体4,通过硫氧还蛋白相互作用蛋白/NLRP3炎症小体轴调节脊髓神经胶质细胞NP[35]。NLRP3介导半胱天冬蛋白酶-1活化和促炎细胞因子IL-1β或IL-18 的分泌在神经痛信号转导过程中表现出明显优势[36]。

5.3 介导长链非编码RNA BANCR激活提高神经元自噬水平

自噬对神经元发育至关重要,其失调会导致神经退行性疾病。BANCR位于9q21.11-q21.12的基因沙漠区域,是一种长度为693 bp的长链非编码RNA,通过影响细胞增殖、迁移、侵袭、细胞凋亡和上皮到间充质的转变来确定其在疾病发生中的重要性。研究发现减弱BANCR表达能激活神经元中微管相关蛋白轻链(microtubule-associated protein 1light chain 3II,LC3II)自噬体水平,降低选择性自噬接头蛋白(sequestosome 1,SQSTM1/p62)积累和神经毒性[38-39]。龙炳材等人发现推拿能通过抑制长链非编码RNA BANCR的表达,上升LC3II及降低p62蛋白表达,提高自噬水平,清除促炎因子IL-1β累积,减轻大鼠的痛觉过敏行为[40]。以上结果为进一步理解推拿调控NP中的细胞自噬提供了新的视角,并可能为NP的治疗提供有力的理论依据和治疗靶点。

5.4 调节Toll样受体4表达

Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)是一类跨膜信号转导受体,介导固有免疫,识别病原相关模式分子。多项研究证实TLR4在NP中发挥重要作用。Wang等人发现SNL模型建立后第14天,TLR4、TNF-α和IL-6的表达水平显著升高;这表明在NP中TLR4信号通路被激活,进一步诱导炎症反应的发生,导致疼痛的感知,而推拿干预14天后,TLR4、TNF-α、IL-6表达显著下降,提示推拿通过抑制受体TLR4的表达,减少促炎因子TNF-α、IL-6表达,从而抑制炎症反应[41]。但推拿如何调控TLR4尚不清楚,需要更多的研究来了解这些变化对疼痛的特异性以及在疼痛病理生理学中可能的因果作用。

6 减少伤害感受器表达

伤害感受器是检测破坏性或潜在破坏性刺激的特殊感觉神经元,存在于背根神经节和三叉神经节中。许多类型的受体在疼痛感中被激活,其信号通路各不相同。这些信号通路可以看作是通过靶向疼痛转导分子产生镇痛来调节疼痛的部位。在其解剖学位置的基础上,瞬时受体电位离子通道、压电型机械敏感离子通道组件、酸感应离子通道、嘌呤能、缓激肽等在疼痛致敏期间被激活[42]。这些神经元对于最终产生疼痛感知的神经元信号至关重要,而推拿作用于以下伤害感受器神经元治疗急性和慢性疼痛。

6.1 降低三磷酸腺苷受体P2X3表达

含有P2X3的受体做为三磷酸腺苷依赖性离子通道,是调节伤害性信号的关键靶标。背根神经节中P2X3的敲低逆转了慢性缩窄损伤诱导的集落刺激因子1上调、脊髓小胶质细胞激活和神经性疼痛样行为[43]。CCI大鼠脊髓背角中P2X3受体表达增加导致大鼠机械性异常性疼痛和热痛觉过敏,而奈铁碱显著降低上调的P2X3受体和IL-1β,抑制CCI大鼠脊髓背角中ERK1/2的磷酸化和活化,缓解神经性疼痛[44]。秦丽发现推拿通过CCI大鼠脊髓背角中蛋白激酶C-P2X3通路缓解外周NP,其机制可能与推拿通过降低脊髓背角中的蛋白激酶C、P2X3的蛋白表达水平,抑制疼痛信号进一步向上传递有关[45]。检测失调P2X3的水平可能为未来NP的诊断、治疗和评估提供一种有前景的方法。

6.2 下调压电型机械敏感离子通道组件2表达

机械性疼痛反应发生与压电型机械敏感离子通道组件1/2(piezoelectric mechanical sensitive ion channel assembly 1/2,Piezo1/2)在感觉神经元中表达水平有关[46]。Piezo2是一种快速适应、机械激活的离子通道,低阈值机械感受器的机械敏感性强烈依赖于Piezo2,在体外显示快速适应,机械激活电流的单个离子通道负责参与无害触觉的大多数低阈值机械感受器亚型的机械敏感性[47],缺乏Piezo2的小鼠对机械刺激的伤害性反应受损并响应机械刺激的Aδ伤害感受器和C纤维放电减少。Piezo2介导炎症和神经损伤诱导的致敏性机械疼痛[48],并表明靶向Piezo2可能是治疗机械性异常性疼痛的有效策略。宋鹏飞[49]通过“L”类钢筋单侧脊髓背角压缩建立的CCD大鼠疼痛模型中,通过推拿干预进行痛觉超敏的行为监测,采用免疫组织化学和免疫迹法分析Piezo1和Piezo2在有髓神经纤维中的表达,发现空白组和CCD组的Piezo2表达较高,Piezo1表达较低。推拿干预后神经病理性疼痛行为减轻,Piezo2的表达被下调,Piezo1增加。以上研究表明推拿能通过脊髓背角轴突内的压电机械敏感通道发挥抗炎镇痛的作用,有助于进一步研究推拿通过伤害感受器影响NP的详细机制,改变了对推拿作用认识传统的研究思路。

7 调节中枢去抑制

在中枢神经系统中,下行系统的存在是为了内源性地调节对疼痛的感知, 中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)和口腹内侧髓质(rostral ventromedial medulla,RVM)投射的下行途径,以抑制脊髓背角的上行伤害性传递。有学者提出阿片类药物和大麻素通过γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)去抑制的间接过程激活下行镇痛-抑制抑制性GABA能输入到构成下行镇痛途径的输出神经元,GABA能抑制张力的功能减退是突触传递增强的重要因素,突触异常传递通常导致脊髓损伤后背角神经元的神经元过度兴奋[50]。而同时GABA能神经元活性的慢性增加抑制了中脑腹侧被盖区中的多巴胺能神经元活动,并负责负面情绪和脊髓损伤诱导的NP的发生[51]。

张磊[52]运用“以痛为腧”环跳穴推拿按压法对坐骨神经结扎处进行推拿,4周干预治疗后发现NP-CCI大鼠推拿组PAG、RVM核群内GABA 和 GABAAR的平均光密度值明显高于模型组。这提示推拿降低大鼠痛觉超敏,缓解NP的机制可能与PAG、RVM核群内 GABA 及 GABAAR含量增加有关。这为揭示推拿治疗神经病理性的中枢致敏分子方面取得了重大进展,这一突破有望极大地促进对此类病症的全面了解和治疗。

8 小结与展望

《黄帝内经》云:“经络不通;病生于不仁,治之以按摩”,《医宗金鉴·外治法》也云:“按其经络,以通郁闭之气,摩其壅聚,以散瘀结之肿,其患可愈”。可见推拿作为一种有效的镇痛治疗方式,具有运行气血、调和荣卫、疏经止痛的功效。综合上述的研究可知,中医推拿能够通过调节胶质细胞、离子通道、伤害感受器表达等方式调控啮齿类动物外周神经损伤介导的NP,进一步说明了在疼痛中推拿的镇痛效果。但对中医推拿的镇痛机制研究尚处于初级阶段。推拿对NP的镇痛机制研究是本团队在对推拿调治躯体疼痛性亚健康、偏头痛、腰痛病的临床研究基础上提炼出来的科学问题。

NP的发展与神经炎症、神经凋亡和突触可塑性有关,并受兴奋—抑制平衡、下行通路的影响、分子中介体与可塑性、离子通道的改变、代谢物、缺氧、线粒体因素及胶质细胞衍生的介质等调控。而推拿治疗NP多从胶质细胞激活、离子通道和兴奋—抑制不平衡的抑制性受体导致的神经炎症为主,特别是推拿对外周和脊髓通路的神经炎症反应,当前取得了重大进展,对细胞自噬层面也有一定的研究。但涉及大脑中的可塑性机制却知之甚少,对NP中的神经节细胞、轴突和髓鞘损伤、脊髓背角萎缩方面尚未有触及。除此,在最新研究中发现RNA的m6A甲基化、内质网应激以及细胞铁死亡参与了NP的发生发展,能否从这些方面更深层的挖掘推拿的镇痛机制还需进一步研究。