早期胃癌组织MCM4表达与内镜黏膜下剥离术后疾病复发的关系

王玉玉,常廷民,杨芳,姬娟娟,李光艳,刘英娇

(新乡医学院第一附属医院 a.内镜科;b.消化内科,河南 新乡 453100)

胃癌是常见的消化道肿瘤之一,具有进展迅速、恶性程度高的特点[1]。当癌组织仅局限于胃黏膜层或下层时属于胃癌早期,多采用内镜黏膜下剥离术治疗,不会破坏正常胃结构和分泌功能,患者术后恢复快、生存率高,治疗效果与根治性切除术相当[2],但术后仍存在复发风险[3]。目前,明确早期胃癌内镜黏膜下剥离术后复发的影响因素对指导临床早期评估和干预具有重要意义。微小染色体维持蛋白(microchromosome maintenance protein,MCM)由三磷酸腺苷酶亚类结构组成,可与DNA复制起点结合参与DNA的复制起始,具有高度保守性[4]。MCM4是MCM家族的一员,近年来研究发现其在乳腺癌[5]、肝细胞癌[6]等中过表达,对肿瘤诊断和预后具有评估作用。然而,该蛋白在早期胃癌中的表达与术后复发是否存在关联尚需探讨明确。故本研究采用免疫组化法检测早期胃癌组织MCM4表达,并探讨其对术后复发的影响,旨在为临床干预提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年2月至2020年1月在新乡医学院第一附属医院接受内镜黏膜下剥离术的273例早期胃癌患者作为观察组,男147例,女126例,年龄39～68(54.24±7.76)岁。纳入标准:符合早期胃癌诊断标准[7],并经内镜和病理活检初次确诊;符合内镜黏膜下剥离术指征[8]。排除标准:术前或术后放、化疗;合并严重心、肝、肾等器官衰竭;合并其他恶性肿瘤;长期接受激素、免疫抑制剂治疗;随访期间失访。另同期选取接受胃镜下胃黏膜活检正常的200例受试者作为对照组,男112例,女88例,年龄36～70(53.61±8.07)岁。研究组和对照组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院医学伦理委员会审批,所有受试者均自愿签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1MCM4表达免疫组化检测

(1)收集观察组胃癌组织和对照组正常胃黏膜组织进行固定、石蜡包埋,制成4 μm的切片;(2)75 ℃烘烤切片30 min,经二甲苯脱蜡、梯度乙醇浸泡水化后在柠檬酸缓冲液中放置20 min提取抗原,阻断内源性过氧化物酶活性充分反应,然后用牛血清白蛋白封闭;(3)先用MCM4兔抗人单克隆抗体(英国Abcam公司),稀释100倍后孵育切片2 h,再用生物素标记二抗孵育切片1.5 h,用二氨基联苯胺显色试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)进行显色,复染;(4)结果判读:在显微镜下随机选5个不同视野观察,MCM4定位于细胞质。参照刘宾等[9]的判读标准,根据阳性细胞百分比和阳性细胞染色程度进行判读,阳性细胞占总细胞<20%、20%～50%、>50%～70%、>70%分别记0、1、2、3分;细胞无染色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记0、1、2、3分,计算两项总分之和,≤2分为低表达,≥3分为高表达。

1.2.2资料收集

收集早期胃癌患者的资料,包括性别、年龄、病灶位置、病灶最大直径、浸润程度、分化程度、镜下分型等。

1.2.3术后随访

患者定期来院复诊,术后第1年每3个月复诊1次,之后每6/12个月复诊1次,复查胃镜,对疑似复发患者行内镜和病理活检,其中原病灶切除部位及临近部位新生肿瘤即为复发。以2023年1月作为随访截点,统计患者术后3 a内复发情况,并将其分为复发组和未复发组。

1.3 观察指标

(1)观察组胃黏膜癌组织和对照组胃黏膜正常组织MCM4表达;(2)不同病理特征早期胃癌患者胃黏膜癌组织MCM4表达;(3)早期胃癌组织MCM4不同表达患者术后复发的Kaplan-Meier曲线;(4)早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的影响因素分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 观察组胃黏膜癌组织和对照组胃黏膜正常组织MCM4表达

观察组胃黏膜癌组织MCM4高表达率高于对照组胃黏膜正常组织(P<0.05),见图1和表1。

A为对照组正常胃黏膜组织;B为观察组胃黏膜癌组织。

表1 观察组胃黏膜癌组织和对照组胃黏膜正常组织 MCM4表达比较[n(%)]

2.2 不同病理特征早期胃癌患者胃癌组织MCM4表达比较

不同性别、年龄、病灶位置、病灶最大直径、镜下分型早期胃癌患者胃癌组织MCM4高表达率差异无统计学意义(P>0.05),黏膜下层浸润、低/未分化早期胃癌患者胃癌组织MCM4高表达占比分别高于黏膜内层浸润、高/中分化患者(P<0.05),见表2。

表2 不同病理特征早期胃癌患者胃癌组织 MCM4表达比较[n(%)]

表2(续)

2.3 早期胃癌组织MCM4不同表达患者术后复发的Kaplan-Meier曲线

早期胃癌患者术后3 a复发率为11.36%(31/273),其中24例患者胃癌组织MCM4为高表达,7例为低表达。Kaplan-Meier曲线显示,胃癌组织MCM4高表达患者术后3 a复发率低于低表达患者(χ2=40.235,P<0.001),见图2。

MCM4为微小染色体维持蛋白4。

2.4 早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的影响因素分析

复发组和未复发组性别、年龄、病灶位置差异无统计学意义(P>0.05),病灶最大直径、浸润程度、分化程度、镜下分型、胃癌组织MCM4表达差异有统计学(P<0.05),见表3。将病灶最大直径(<2 cm=0,2～3 cm=1,>3 cm=2)、浸润程度(黏膜内层=0,黏膜下层=1)、分化程度(高/中分化=0,低/未分化=1)、镜下分型(Ⅰ型=0,Ⅱa型=1,Ⅱb型=2,Ⅱc型=3,Ⅱa型+Ⅱc型=4)、胃癌组织MCM4表达(低表达=0,高表达=1)作为自变量,将术后有无复发(未复发=0,复发=1)作为因变量,纳入Cox回归模型分析,结果显示,病灶最大直径>3 cm、黏膜下层浸润、低/未分化及胃癌组织MCM4高表达均是早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的危险因素(P<0.05),见表4。

表3 复发组和未复发组临床资料比较[n(%)]

表4 早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的Cox回归分析

3 讨论

随着内镜设备和技术的进步,内镜黏膜下剥离术已成为早期胃癌治疗的主要术式之一,早期胃癌患者经规范治疗5 a生存率可达到90%以上[10]。既往大量研究报道[11-13],早期胃癌内镜黏膜下剥离术疗效良好,但术后1 a仍有3.77%～9.81%的复发率,术后3 a复发率可达12.62%。本研究中术后3 a复发率为11.36%,与上述研究报道基本相符,均提示早期胃癌内镜黏膜下剥离术后仍存在复发情况。因此,探讨影响早期胃癌内镜黏膜下剥离术后复发的因素对指导临床早期干预、进一步改善远期预后具有重要意义。

MCM2-7异六聚体复合物对DNA复制和细胞周期进程起调控作用,近年来在肿瘤领域广受关注。MCM4是 MCM复合物的一部分,参与 DNA复制的起始,还是复制叉处解开 DNA 复制解旋酶的核心,既往研究报道MCM4高表达参与多种癌症的发生[14-15]。本研究发现MCM4在早期胃癌组织中高表达率高于普通受试者胃黏膜正常组织,提示MCM4高表达可能影响胃癌发病。本研究还发现黏膜下层浸润、低/未分化早期胃癌患者胃黏膜癌组织MCM4高表达占比分别高于黏膜内层浸润、高/中分化患者,提示MCM4表达可能与早期胃癌浸润程度和分化程度有关,检测MCM4表达可能对了解早期胃癌进展程度具有参考意义。肿瘤生长包括肿瘤细胞增殖、分化、迁移等,其中细胞增殖失控是肿瘤发展的重要环节。MCM4调控细胞周期,既往研究发现MCM4表达与细胞细胞周期蛋白E、细胞增殖抗原标志物Ki-67表达显著相关,可作为评估肿瘤发生和进展的更敏感细胞增殖标志物[16]。魏敏等[17]也报道MCM4基因主要富集于细胞周期,MCM4高表达水平与子宫内膜癌的病理分期、组织学分级密切相关。

本研究绘制Kaplan-Meier曲线比较胃癌组织MCM4高表达和低表达患者术后复发情况,发现高表达患者复发率高于低表达患者,并且进一步采用Cox分析发现胃癌组织MCM4高表达是早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的危险因素。MCM4影响癌细胞恶性增殖行为,过表达可能促进癌细胞生长进而增加复发风险。既往Xu等[18]也指出MCM4过表达与肝细胞癌预后不良相关,沉默MCM4可抑制癌细胞增殖和球体形成,有望成为其治疗靶点。另外,本研究还发现病灶最大直径>3 cm、黏膜下层浸润、低/未分化也是早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的危险因素。病灶直径越大,手术完整切除病灶的难度越高,容易出现微小残留导致复发;黏膜下层浸润增加内膜剥离难度,可能存在未完全剥离情况,导致复发风险增高;分化程度是反应肿瘤恶性程度的重要指标,分化程度越低,肿瘤生长、侵袭力越强,术后复发风险也越高,既往Ishioka等[19]也报道早期胃癌内镜黏膜下剥离术后未分化型癌相比分化型治愈性切除率低,术后复发率高。因此,在早期胃癌患者型内镜黏膜下剥离术前需准确了解病灶大小和浸润,提升手术医生水平,术后根据病理检查结果合理安排复诊频次,以便早期干预,改善患者预后。

4 结论

MCM4在早期胃癌组织中呈高表达,与浸润程度和分化程度有关,其与病灶最大直径>3 cm、黏膜下层浸润、低/未分化均是早期胃癌患者内镜黏膜下剥离术后复发的危险因素,提示MCM4可能是评估早期胃癌术后复发风险的新型生物标志物。