酶底物光谱法与酶底物法检测水中大肠菌群的比较分析

王莉莉

(1.广西北投环保水务集团有限公司,广西南宁 530025;2.南宁市水安全工程技术研究中心,广西南宁 530025)

世界卫生组织统计,每年全球超过150万人由于饮用不安全的水死于腹泻病,其中大多数是婴幼儿。与饮用水相关的最常见和最普遍的健康风险来自通过粪便传播的微生物病原体引起的污染。全球最常用的水被粪便污染的指示菌是大肠埃希氏菌,每100 mL样品中大肠埃希氏菌超过100 CFU被认为是“非常高风险”的粪便污染水平,如未检出可被认为是低风险的[1]。据文献[2]显示,我国地表水体粪大肠菌群含量普遍较高,受到较为严重的粪便污染,其中河流水系含量最高,湖泊、海域次之。原水粪大肠菌群污染的加剧对水域游泳等直接身体接触活动人群存在明显健康影响[3],水体中粪大肠菌群含量与有机物、富营养化程度正相关[2]。因此,检测水中大肠杆菌含量对于预防疾病、居民健康、水源保护、水质评价及风险预警等具有重要作用和意义。目前,在生活饮用水、环境水、城镇污水相关的国家水质卫生标准文件中,对于水质大肠菌群的浓度表征及风险提示,主要采用总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群3项指标,此3项指标是常用于评价水体被粪便污染程度的指标菌,检测方法以多管发酵法、滤膜法为主,其次为酶底物法。酶底物法具有操作简单、快速、准确的优势[4-7],近10年在国内得到广泛推广运用。目前市场上出现一类基于酶底物反应原理的水质微生物自动检测分析仪,具备一键操作完成检测及报告结果的功能。本文采用检测仪(酶底物光谱法)与国标酶底物法检测不同类型的水质样品中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群指标,研究两种检测方法的相关性,采用酶底物光谱法检测有证标准物质,验证该方法的准确性,为开展水质大肠杆菌的检测提供备选方法。

1 试验材料和方法

1.1 主要设备与材料

TECTA-B16全自动微生物检测系统(检测仪)、TECTA测试套筒由北京华夏科创仪器股份有限公司提供;无菌采样瓶、97孔定量盘、科立得试剂等耗材购自美国IDEXX公司授权的经销商;HJQC-003酶底物法质控样品购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。其余主要试验设备包括程控定量封口机、紫外线灯、上海一恒电热培养箱。

1.2 方法原理

(1)酶底物光谱法:在特定温度下培养特定的时间,总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群能产生β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶,分解选择性培养基中的底物生成荧光物质;利用光学原理,通过进行连续的分光光度测定,依据待测水样荧光强度的变化与水中待测目标细菌的浓度的特殊对应关系,建立相关数学模型从而测定总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的浓度。反应原理如图1所示。

图1 酶底物光谱法的反应原理

(2)酶底物法:酶底物试剂包含ONPG和MUG这两种营养指示剂,分别会被大肠菌群酶(β-半乳糖苷酶)和大肠埃希氏菌酶(β-葡糖醛酸酶)代谢。在特定温度下培养特定的时间,总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌生长代谢过程中产生特异性的酶,使培养基产生显色反应,样品从无色变成黄色;大肠埃希氏菌的产物在紫外灯照射下有蓝色荧光。通过统计阳性反应数量,查最大可能数(MPN)表,可以计算出对应项目指标的浓度值。

1.3 试验步骤

(1)酶底物光谱法:参照全自动微生物检测系统的仪器操作说明书进行。根据检测项目,在微生物检测仪上选择相应的测试模式。接种待测水样于装有培养基的一次性测试套筒中,定容至100 mL,水样与培养基应充分混匀,将接种后的测试套筒放置于仪器中,经过2～18 h培养,仪器自动输出检测结果。测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时,接种到CCA测试套筒,培养温度为(35.5±0.2)℃;测定粪大肠菌群时,接种到FCA测试套筒,培养温度为(44.5±0.2)℃。检测样品的操作步骤如图2所示。

图2 酶底物光谱法检测样品的操作步骤

(2)酶底物法:依据《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》(HJ 1001—2018)、《生活饮用水标准检验方法 第12部分:微生物指标》(GB/T 5750.12—2023)5.3酶底物法、7.3酶底物法中的检测步骤进行[8-9]。

(3)以南宁地区实际样品进行试验,生活饮用水、井水样品依据《生活饮用水标准检验方法 第2部分:水样的采集与保存》(GB/T 5750.2—2023)进行采样,地表水、污水等样品依据《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》(HJ 1001—2018)进行样品采集和保存。采样容器为灭菌玻璃瓶,也可用市售无菌采样瓶或无菌采样袋替代,如样品含有余氯,可在玻璃瓶灭菌处理前预先添加硫代硫酸钠[8,10]。

(4)数据统计分析使用Office和IBM SPSS Statistics软件,绘图使用Origin 2022软件。

2 结果与讨论

2.1 实际样品的检测分析

(1)对南宁地区生活饮用水43个样品(包括自来水厂出厂水18个样品、市政管网水25个样品)检测总大肠菌群、大肠埃希氏菌。两种方法对生活饮用水的检测结果均为阴性、未检出,可认为两种方法试验结果具有一致性,均可有效检测洁净水中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌。

(2)对南宁地区30个环境水样品检测总大肠菌群、大肠埃希氏菌,样品类型包括井水、地下水、地表水,检测结果如表1所示。因为微生物检测数据属于偏态分布,所以将测定结果以10取对数后进行计算。因为0没有对数,结果为未检出(<1)的数据在统计时按0.1进行对数处理。运用SPSS软件对处理后数据进行配对t检验,结果显示:两组总大肠菌群的数据P=0.057(P>0.05),相关系数r=0.904;两组大肠埃希氏菌的数据P=0.593(P>0.05),相关系数r=0.972。结果表明,比对数据相关性较好,两种方法在检测总大肠菌群、大肠埃希氏菌时没有统计学意义上的显著差异性,具有等效性、可比性。结果比较如图3所示。

表1 两种方法检测南宁地区环境水样品中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌的结果

图3 两种方法检测南宁地区环境水样品中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌的对数结果比较

(3)对南宁市区污水处理厂30个污水样品检测粪大肠菌群,污水样品包括城镇污水处理厂的进厂污水、经工艺处理后污水,检测结果如表2所示。运用SPSS软件对处理后数据进行配对t检验,通过计算得出P=0.136(P>0.05),相关系数r=0.986。表明比对结果呈现较好的相关性数据支持,在检测粪大肠菌群时可获得两种方法无显著差异性,具有等效性、可比性的结论。结果比较如图4所示。

表2 两种方法检测南宁市区污水处理厂污水样品中的粪大肠菌群的结果

图4 两种方法检测南宁市区污水处理厂污水样品中的粪大肠菌群的对数结果比较

试验结果表明,酶底物光谱法在检测不同类型的实际样品时,与酶底物法作为对照,检测结果一致、等效,可有效检测水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌及粪大肠菌群,可作为检测新方法。

2.2 酶底物光谱法对有证质控样品的检测

酶底物光谱法对有证质控样品的检测结果如表3所示。结果表明:总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的检测结果均在质控样品的参考值范围内,酶底物光谱法可以准确检测定量质控。

表3 酶底物光谱法检测定量质控样品的结果

2.3 方法比对

(1)在检测时长、结果报告方面,酶底物光谱法更有效率。酶底物法的培养时间为24～28 h,培养

时间固定,人工计数查MPN表报告结果;酶底物光谱法是快速法,培养时间为2～18 h,检测仪运用样品酶反应产生荧光强度的时间与目标细菌浓度建立标准曲线,自动控制培养时间,大肠杆菌大于1×106CFU/(100 mL)的高污染样品检测时间短,最快2 h,大肠杆菌小于1 CFU/(100 mL)的样品检测需18 h。检测仪自动报告结果,可以联网发送结果到手机,无需人员值守实验室等待,提高了工作效率的同时降低人工计数误差,可满足提前预警降低危害、及时提示风险的功能需求,满足应急快速检测的需求。

(2)酶底物光谱法在检测时水样不受浑浊度、色度的影响。由于酶底物光谱法所使用的化学培养基是一种疏水性试剂,当发生反应时,荧光分子作为指示剂快速地从水样中移动到套筒内的聚合物光学传感器中,由系统中的微型光谱仪自动完成检测。因此,可以避免来自水样中悬浮物、杂质、水样本底颜色等的干扰。用酶底物法检测样品,其浑浊度、色度较高时,存在一定的干扰,需要做样品本底对照,在结果计数时辅助辨别颜色。

(3)酶底物光谱法在无需稀释水样时,具有更宽的测量范围。酶底物法的测量值为1～2 419.6 MPN/(100 mL),酶底物光谱法的测量值为1～1×108CFU/(100 mL),后者可减少稀释次数,降低稀释误差。

(4)酶底物法可用于实验室常规检测、应急检测,能满足大批量样品的微生物检测需求。酶底物光谱法的检测仪是集合样品培养和检测功能的一体机,配置有16个样品位置,适合检测样品批量和数量少的实验室。

(5)酶底物光谱法比酶底物法在操作上进一步提升便捷性和效率,但其检测仪器、耗材成本也更高。市场上同类型酶底物光谱法检测仪有台式仪器和便携式仪器,其价格是酶底物法设备的3～6倍,其单个耗材费用为酶底物法的1～2倍。

3 结论

(1)试验测定不同类型的实际水样中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌及粪大肠菌群指标,检测结果统计分析表明酶底物光谱法与酶底物法无统计学意义上的显著性差异。由于比对的样本数量不够多,比对结果亦存在一定的局限性。

(2)酶底物光谱法可以准确检测以上3项水质粪便污染指示菌。

(3)酶底物光谱法已经列入山东省地标《水质 粪大肠菌群测定 光度法》(DB 37/T 3787—2019),暂未列入国家其他水质标准中。此外,该方法检测成本相对较高,因此,在实验室开展常规检测时通常不会作为首选方法,但是有条件的实验室可将其列为传统检测方法(如多管发酵法、滤膜法)的比对方法,作为国标检测方法的有益补充,丰富和完善实验室的多元化检测方法体系。

(4)酶底物光谱法具有操作步骤简易、检测效率高、无需稀释条件下测定范围较宽、方便携带及远程传输数据等优点,在应急突发事件现场检测、风险预警方面具有较强的应用前景和优势。