基于指纹图谱和网络药理学的经典名方三化汤质量标志物预测△

倪天婷，谈仲川，梅佳钰，罗鑫，朱靓婷，高洁，干国平，2*

1.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065；

2.湖北省中药炮制工程技术研究中心，湖北 武汉 430065

经典名方是古代医家长期临床实践经验的结晶，已成为我国中药新药研发的重要源泉[1]。三化汤出自刘完素《素问病机气宜保命集》[2]，收载于《古代经典名方目录（第一批）》[3]，处方由大黄、枳实、厚朴、羌活4 种药味组成，具有祛风泻热、清热通便、通腑导滞功效，用于治疗中风入脏、大便不通等[4-5]。本课题组拟对三化汤进行新药开发研究。

药效成分量值传递规律是开发古代经典名方过程中的重点研究内容，首先需明确其药效成分，但由于中药化学成分复杂，因此需要采用中药分析学、网络药理学等多学科交叉技术，通过多成分、多途径、多靶点研究其药效成分及治疗作用。中药指纹图谱利用现代分析方法对中药的药效化合物进行表征，并将其与化学计量学结合，更客观地反映中药的完整性和差异性，是目前常见的发现共有成分和评估质量一致性的方法[6]。网络药理学通过建立成分-靶点-通路的网络拓扑学关系，预测药物与疾病之间的关系，其整体性、系统性的特点符合中医药整体观、辨证论治的原则[7]。

中药质量标志物（Q-marker）是以现代科学和生物技术为研究手段，对中药形成全过程中的化学物质组成及其传递变化规律进行鉴定和阐明，并按照可测性、特有性、传递与溯源、有效性和处方配伍5 项基本原则提炼得到的活性成分（群），用以建立中药全过程质量控制与溯源体系[8]。因此，本研究基于Q-marker 理论，整合高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱、化学计量学及网络药理学，从生物信息学和化学角度分析预测经典名方三化汤潜在的Q-marker，为三化汤质量控制研究提供参考依据。

1 材料

1.1 样品

15 批不同来源的大黄、枳实、厚朴、羌活均由湖北中医药大学杨红兵教授鉴定，分别为药用大黄Rheum officinaleBaill.、酸橙Citrus aurantiumL、厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils、宽叶羌活Notopterygium franchetiiH.de Boiss。利用随机数表法将厚朴、羌活、大黄、枳实4 味药不同批次随机组合，样品信息见表1。

表1 三化汤样品各药味批号、产地信息

1.2 仪器

LC-20AD 型高效液相色谱仪（岛津公司）；JY/YP 5002 型电子天平（上海上天精密仪器有限公司）；30MF5 3L 型微电脑养生壶（潮州市潮安区龙光电器有限公司）；AS 系列超声波清洗机（天津市特赛恩斯仪器有限公司）；HHS-2S 型电子恒温不锈钢水浴锅（上海虞龙仪器设备有限公司）；BS210S型万分之一天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；AB135-S型十万分之一天平（Mettler-Toledo公司）。

1.3 试药

对照品厚朴酚（批号：Y2TJ10191584）、和厚朴酚（批号：Y2806135149）均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%；辛弗林（批号：AF21031451）、柚皮苷（批号：AF21101953）、新橙皮苷（批号：AF21082352）、紫花前胡苷（批号：AF20060610）、芦荟大黄素（批号：AF20021623）、大黄素甲醚（批号：AF20051502）均购于成都埃法生物科技有限公司，纯度≥98%；对照品橙皮苷（批号：110721-201818，纯度：96.20%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度：96.0%）、大黄酚（批号：110796-201922，纯度：99.4%）、大黄酸（批号：110757-201607，纯度：99.3%）均购于中国食品药品检定研究院；色谱级甲醇、乙腈购于Sigma公司；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件

采用YMC C18色谱柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.01%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，5%B；5～13 min，5%～17%B；13～36 min，17%B；36～55 min，17%～20%B；55～105 min，20%～70%B；105～115 min，70%～90%B；115～125 min，90%B；125～130 min，90%～5%B）；柱温为30 ℃；检测波长：0～10 min，224 nm；10～60 min，285 nm；60～80 min，310 nm；80～93 min，254 nm；93～105 min，310 nm；105～130 min，254 nm；流速为1 mL·min-1；进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 三化汤物质基准的制备 根据文献考证[9-14]及本课题组前期实验结果，确定三化汤物质基准的制备方法：取厚朴、大黄、枳实、羌活各31 g，各药味先切碎过3目筛，不过8目筛，加水600 mL，浸泡30 min，加盖，用微电脑养生壶煎煮，武火（500 W）煎煮8 min，再用文火（200 W）煎煮约22 min，200目筛滤过，滤液定容至300 mL，即得。

2.2.2 混合对照品的制备 将精密称量的柚皮苷、辛弗林、紫花前胡苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、和厚朴酚、异欧前胡素、厚朴酚、大黄酚、大黄素甲醚对照品加乙腈-水（50∶50）制成质量浓度分别为4 328.52、1 415.57、728.63、299.06、3 645.78、25.06、86.99、28.95、19.43、17.36、27.56、30.12、15.04 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取三化汤物质基准5.0 mL，用乙腈-水（50∶50）混合溶剂稀释20倍，混匀，滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 减去处方中待测药味，称取其他3味药物，先按2.2.1项下方法制成阴性样品，再按2.2.3项下方法分别制成4种阴性样品溶液。

2.2.4 对照药材溶液的制备 分别取大黄、枳实、厚朴、羌活粗颗粒各31 g，按2.2.1 项下和2.2.3 项下方法分别制成4种对照药材溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 参照峰选择 在标准色谱图中紫花前胡苷分离度好、峰面积大、峰形好且稳定，故选择紫花前胡苷作为参照，计算15 批三化汤物质基准指纹图谱中各色谱峰共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

2.3.2 精密度试验 取同一供试品溶液，重复进样6 次，以紫花前胡苷为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.3.3 重复性试验 按照2.2.3 项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进行测定，以紫花前胡苷为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.3.4 稳定性试验 取同一批供试品，于0、3、6、9、24 h 进行测定，以紫花前胡苷为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.4 指纹图谱的建立与相关性分析

2.4.1 三化汤指纹图谱的建立 取15 批三化汤物质基准，按2.2.3 项下方法制备供试品溶液，进样分析，将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），随机选取S1（SHT01）为参照，采用中位数法，进行多点校正和全谱峰匹配分析，生成15批三化汤指纹图谱以及对照指纹图谱。

2.4.2 相似度评价 将15 批三化汤色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）计算相似度。

2.4.3 共有峰的确认及指纹图谱峰归属 分别吸取2.2 项下制备的对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按2.1 项下色谱条件进行测定，对指纹图谱峰进行归属及指认。

2.5 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）

使用统计数据分析软件SIMCA 13.0 对15 批样品的指纹图谱进行OPLS-DA。采用变量重要性投影（VIP）值确定物质基准影响较大的物质。

2.6 网络药理学研究

2.6.1 三化汤活性成分靶点筛选 通过ccTCM 数据库（http://cctcm.org.cn/）搜索13 个成分的靶点，通过PubChem 数据库（https://pubchem.nehi.nlm.nih.gov）下载指认的13 个活性成分的分子结构式，以SMILES 形式导入SwissTargetPrediction 平台（http://www.swisstargetprediction.ch），设置物种为“Homo sapiens”获得蛋白质靶点信息，设置Probability＞0，得到化合物的作用靶点。

2.6.2 疾病靶点的收集 三化汤有治疗卒中、脑缺血、利尿、通便的功效，故通过GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）和DisGNET（https://www.disgenet.org）数据库，以“stroke”“laxative”“diuresis”“cerebral ischemia”为关键词进行检索，合并得到疾病的靶点，去除重复值，得到疾病靶点。

2.6.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 通过韦恩图，对2.6.1 项下收集的活性成分靶点与2.6.2项下收集的疾病靶点进行交集，将得到的交集靶点导入String 数据库（https://cn.string-db.org/），进行PPI 分析。以“Homo species”作为分析物种，“minimum required interaction score”选择“highest confidence（0.900）”，勾 选“hide disconnected nodes in the network”项，分析并下载结果。将结果导入Cytoscape 3.10.0 软件，利用Cyto NCA 插件对数据结果进行分析，选择度（degree）、介度（betweenness centrality）和紧密度（closeness centrality）均大于中位数且度值＞10的靶点作为核心靶点。

2.6.4 基因本体（GO）生物学分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将38 个核心靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov），进行GO 功能分析中基因靶点的生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路富集分析。以P＜0.01为筛选条件，GO 功能分析选取前10条、KEGG通路富集分析选择前20条。

2.6.5 成分-靶点-通路网络构建 将13 个成分、2.6.1 项下靶点、2.6.4 项下前20 条通路，导入Cytoscape 3.7.2软件，构建成分-靶点-通路网络图。

2.6.6 分子对接 通过PubChem 数据库下载13 个活性成分的3D 结构。在PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中下载核心靶点的3D 结构，导入PyMol 2.1.0 软件对靶点蛋白进行去除配体、水。利用AutoDock 1.5.6 软件对小分子配体和蛋白受体进行活性修饰，将处理后的小分子配体和蛋白受体进行对接运算。再导入PyMol 软件进行作图，得到最终的对接图。

3 结果

3.1 方法学考察结果

3.1.1 精密度 计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0.97%～2.06%、0.77%～1.66%，结果表明，仪器精密度满足要求。

3.1.2 重复性 计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0.81%～1.88%、0.32%～1.84%，结果表明，方法重复性良好。

3.1.3 稳定性 计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为0.84%～1.81%、0.69%～2.04%，结果表明，供试品溶液在室温24 h内稳定。

3.2 指纹图谱的建立与相关性分析

3.2.1 三化汤指纹图谱的建立及相似度评价 15批三化汤样品共得到17 个共有峰，叠加指纹图谱及标准指纹图谱见图1、图2。15 批样品的指纹图谱相似度均＞0.97，表明不同批次三化汤样品的相似度较高，生产工艺均一稳定。

图1 三化汤物质基准HPLC指纹图谱

图2 三化汤物质基准标准指纹图谱

3.2.2 三化汤共有峰归属及指认 通过比对供试品溶液、4 味药阴性样品溶液、4 味药对照药材溶液，对17 个共有峰进行归属，结果见图3。峰1、3、4、5、6 归属为枳实；峰7、8、9、10、12、16、17 归属为大黄；峰13、15归属为厚朴；峰2、11、1归属为羌活。通过比对混合对照品溶液和三化汤物质基准供试品溶液指纹图谱，指认出13 个共有峰，分别为辛弗林、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、厚朴酚、异欧前胡素、和厚朴酚、大黄酚、大黄素甲醚。

图3 三化汤物质基准HPLC指纹图谱中色谱峰归属

3.3 OPLS-DA

为了探索影响物质基准质量差异的原因，使用统计数据分析软件SIMCA 13.0 对15 批样品的指纹图谱进行OPLS-DA。15 批样品被明显划分为左右3个区域，见图4。采用VIP值确定物质基准影响较大的物质，选择VIP 值＞1.0 的化合物，得到影响较大的峰为6（新橙皮苷）、4（柚皮苷）、2（紫花前胡苷）、9（大黄酸）、11（未知，归属为羌活）号峰，共5个峰。

图4 15批三化汤物质基准OPLS-DA

3.4 网络药理学研究

3.4.1 三化汤化合物及靶点预测 三化汤样品指纹图谱指认的13个成分在ccTCM、SwissTargetPrediction上搜索和预测相应靶点，去掉重复的靶点，得到499个靶点。

3.4.2 疾病靶点预测 GeneCard 筛选得到5027 个靶点，DrugBank 得到69 个靶点，OMIM 得到95 个靶点，删除重复项，共得到5058个疾病靶点。

3.4.3 PPI 网络构建 绘制韦恩图，得到有效成分靶点和疾病靶点数据集的交集靶点298 个（图5）。PPI网络模型见图6。度、介度和紧密度值均大于中位数且度值＞10 的靶点作为核心靶点，共38个（表2）。

图5 三化汤治疗疾病靶点韦恩图

图6 三化汤治疗疾病靶点PPI网络

表2 三化汤化合物核心靶点

3.4.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3.4.4.1 GO 功能富集分析 运用DAVID 数据库对已整理的核心靶点进行GO 富集的BP、CC、MF 3个项目进行分析，共得到418 条富集结果。其中BP 289 条，主要富集基因表达的正调控、细胞凋亡过程的负调控、对外源性刺激的反应、肽基丝氨酸磷酸化的正调控、蛋白质磷酸化的正调控等；CC 39条，主要富集细胞质、大分子复合物、核质、核等；MF 90 条，主要富集酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）结合、泛素蛋白连接酶结合、激酶活性等过程。根据P值选取前10条通路展示，见图7A。

图7 三化汤治疗疾病靶点GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3.4.4.2 KEGG 通路富集分析 运用DAVID 数据库对已整理的潜在靶点进行KEGG 通路富集，共得到157 条富集通路，其中主要富集到的通路是内分泌抵抗、脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌、结直肠癌、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路等。根据P值选取前20 条KEGG 通路展示，见图7B。

3.4.5 成分-靶点-通路网络构建 将指纹图谱中指认的13 个化合物及其对应靶点、20 条通路及其富集靶点导入Cytoscape，构建成分-靶点-通路网络，见图8。结果表明，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚与靶点及通路的连接强度较大。

图8 三化汤治疗疾病成分-靶点-通路网络

3.4.6 分子对接 由PPI 网络可知，三化汤中发挥疗效的主要为肿瘤蛋白P53（TP53）、Akt1、90 kDa热休克蛋白αA1（HSP90AA1）、非受体酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（PIK3CA）等靶点，将13 个成分与核心靶点Akt1 进行分子对接，结果显示13 个化合物与Akt1 的结合能均小于0，表明核心靶点与成分能在体内自发地结合。分子对接结合能见表3，分子对接结果图见图9。

图9 三化汤13个成分与Akt1分子对接结果

表3 三化汤13个成分与Akt1分子对接结合能 kcal·mol-1

4 讨论

本研究采用HPLC 多波长切换法建立了三化汤的指纹图谱，共筛选出17个共有峰，并对其中13个峰进行了指认。采用化学计量学分析，15 批三化汤物质基准被分为3类，并通过VIP值得出枳实中黄酮类成分及大黄中大黄酸对三化汤的质量影响较大。在指认的13 个成分中，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚归属于大黄，辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷归属于枳实，厚朴酚、和厚朴酚归属于厚朴，紫花前胡苷、异欧前胡素归属于羌活，结果表明13 个成分满足Q-marker中处方配伍及特有性的要求；在《中华人民共和国药典》2020 年版规定三化汤涉及药材指标性成分有芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚（大黄的定量指标成分），辛弗林（枳实的定量指标），厚朴酚、和厚朴酚（厚朴的定量指标），异欧前胡素（羌活的定量指标）[15]。13个成分质量分数在三化汤物质基准中均较高（＞0.01%），在后续的三化汤制备工艺研究中，为了探讨中药-饮片-基准物质的质量传递与溯源，根据三化汤指纹图谱的色谱条件，建立了同时测定13 个成分含量的测定方法，方法学验证结果表明符合指导原则要求，表明13 个成分均满足Q-marker中可测性的原则。

卒中后便秘可能是因为卒中后人的活动能力受限、活动减少，胃肠运动也受到影响，容易导致便秘。吴门医派认为卒中责之肝肾阴虚，水不涵木，卒中之后易向胃阴不足转归而发生便秘[16]。三化汤中大黄的功能主治为泻下攻积、清热泻火，用于实热积滞便秘，其中蒽醌类成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚是大黄的主要活性物质[17]。唐大轩等[18]研究得出大黄中发挥导泻作用的最终物质是蒽醌类成分，其刺激胃肠道分泌，升高胃肠道内蛋白质浓度，进而发生容积性导泻。枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷可促进胃肠动力，有显著促进胃肠蠕动和胃排空的作用，抑制肠道内炎症因子和蛋白质的过度表达，减少对肠黏膜的损伤[19]，改善便秘；辛弗林有松弛胃平滑肌的作用[20]。厚朴中厚朴酚与和厚朴酚均有促进小鼠胃排空和肠推进的作用，和厚朴酚具有抗炎作用[21-23]，在脑缺血的治疗中有良好效果[24]。羌活中紫花前胡苷、异欧前胡素具有抗炎镇痛作用[25]。结果提示三化汤中大黄蒽醌类成分、枳实黄酮类成分及生物碱成分、厚朴中厚朴酚与和厚朴酚、羌活中紫花前胡苷和异欧前胡素有改善胃肠道环境、促进胃肠道蠕动、抗炎、治疗脑缺血的作用。

对13 个成分进行网络药理学预测分析，得出TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 等为三化汤核心靶点。研究发现，激活Akt1可以维持Cajal间质细胞（ICC）的功能，ICC 胃肠道运动有紧密关系[26-27]。TP53 和HSP90AA1 是癌症相关靶点。研究表明，便秘会增加短期内患癌症的风险[28]；Zhang等[29]证实，HSP90AA1 通过正向调节SRP9，使结直肠癌细胞过度增殖。SRC 家族包括膜结合型非受体酪氨酸激酶亚类，其参与各种细胞信号传导途径。研究表明，SRC 磷酸化可增加微血管通透性，并参与血脑屏障损伤后的病理通透过程，抑制SRC 活性可有效保护血脑屏障，减轻脑肿胀[30]。PIK3CA 是PI3K 的催化亚基，参与多种生长因子的细胞信号传导[31]。结果提示，TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 可能与三化汤治疗卒中后二便不通、脑缺血有关。

KEEG 通路主要涉及了癌症通路、内分泌抵抗、脂质和动脉粥样硬化、PI3K-Akt 信号通路等。分子对接对网络药理学结果进行了验证结果显示，13 个成分均能与核心靶点稳定地结合。便秘可能涉及PI3K/Akt 信号通路，Yao 等[32]认为可以通过上调Akt的磷酸化、增强PI3K/Akt 和核转录因子E2相关因子2/血红素氧合酶1（Nrf2/HO-1）信号通路，减少免疫细胞凋亡，进而改善便秘。PI3K/Akt 信号通路被激活后可调控抗神经元凋亡以及促进血管新生保护脑组织[33]。Yan等[34]证实，激活PI3K/Akt/mTOR通路可抑制氧化应激相关的神经元自噬，发挥神经保护功能。脑缺血有可能引起严重的炎症反应、脑水肿和神经功能缺损[35-36]。结果提示三化汤可能是通过TP53、Akt1、HSP90AA1、SRC、PIK3CA 等靶点作用于PI3K/Akt信号通路发挥疗效。

综上所述，三化汤中13 个成分均满足Q-marker五原则，基于VIP 值＞1（新橙皮苷、柚皮苷、紫花前胡苷、大黄酸）、成分含量排名前4（柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林、紫花前胡苷）及成分-靶点-通路网络中连接强度前5（大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚），预测新橙皮苷、柚皮苷、紫花前胡苷、大黄酸、辛弗林、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚10 个成分可能为三化汤的潜在Q-marker，为三化汤质量控制及后续研究提供了参考。

本研究只进行了三化汤指纹图谱与网络药理学的研究，网络药理学的研究存在一定的局限性，后续可以开展三化汤治疗卒中、脑缺血、卒中后二便不通的动物、细胞实验，进一步深入研究三化汤作用机制。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。