基于HS-GC-MS 和电子感官技术比较不同产地金银花气味和味道差异

马涵玉，钱 琪,2,3，王凤霞，周英森，贾振华，孙 帅，牛丽颖,2,3*

1.河北中医药大学，河北 石家庄 050091

2.河北省中药配方颗粒技术创新中心，河北 石家庄 050091

3.中药材品质评价与标准化河北省工程研究中心，河北 石家庄 050091

4.河北省科学院，河北 石家庄 050052

金银花又称忍冬藤花，甘，寒，为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]。金银花在全国各省都有分布，但主要集中于河北、河南、山东等地[2]。不同产地物候条件下采收的金银花质量存在显著差异，其挥发性成分的种类受气候、土壤等条件的影响[3-4]，而多种挥发性成分作用是使金银花拥有“清香”气和“味淡、微苦”[1]性质的关键因素之一，挥发性成分的差异会引起气味和味道的变化，故对不同产地金银花的气味和味道进行量化分析对金银花的产地鉴别有重要意义。目前对不同产地金银花的研究多集中于其所含化学成分种类和含量的测定[5]，而明确不同产地间感官特征和化学成分的差异可为金银花的产地区分提供新的思路与策略。

因此本研究采用HS-GC-MS、电子鼻和电子舌技术对不同产地金银花的挥发性成分、气味和味道及进行研究。通过与质谱库进行比对鉴定挥发性成分，通过电子鼻和电子舌传感器的响应值来确定气味和味道，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）进行分析，寻找河北、河南、山东产地金银花挥发性成分、气味和味道的差异，以期为金银花的产地鉴别及质量评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TQ8050 NX 型气相色谱-质谱联用系统（日本岛津公司）；PEN3 型电子鼻系统（德国AIRSENSE 公司）；SA402B 型电子舌系统（日本Insent 公司）；BSA224S-CW 型电子分析天平（北京赛多利斯有限公司）；KQ-250 型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；TDZ5-WS 型低速离心机湘仪实验仪器开发公司（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；纯化水来自UPR-II-20L 净水系统（四川纯技术公司）。

1.2 材料

41 批金银花样品取自于河南、山东、河北，详细信息见表1，经河北省药品医疗器械检验研究院段吉平中药师鉴定为忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花。

表1 金银花样品信息Table 1 Lonicerae Japonicae Flos sample information

2 方法与结果

2.1 HS-GC-MS 分析

2.1.1 样品前处理 金银花样本粉碎，过40 目筛，称取1.0 g 于20 mL 螺口顶空瓶中，聚四氟乙烯隔垫密封。进样方式：顶空进样；样品加热温度80 ℃；加热时间15 min；进样量1 000 μL。

2.1.2 气相色谱条件 色谱柱：SH-I-5 Sil MS 型毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口250 ℃；载气氦气；载气控制方式：恒线速度控制，83.5 kPa；分流比9∶1；程序升温初始40 ℃，维持2 min，5 ℃/min 升至220 ℃，维持1 min。

2.1.3 质谱条件 离子源温度200 ℃；接口温度250 ℃；电离方式为电子轰击电离源（EI），溶剂延迟时间2 min；检测器电压：相对于调谐结果，0.3 kV；采集时间：3～39 min；采集方式：Q3 Scan；扫描范围m/z50～600。使用质谱库（NIST20）检索，并进行人工比对和解析，结合相似度和保留时间确定化合物。

2.1.4 数据处理 HS-GC-MS 检测结果的鉴定采用NIST20 标准质谱图库检索（相似度≥85%）并结合参考相关文献。使用MSDIAL ver.4.80 软件进行峰的解卷积和峰面积的归一化。利用SIMCA 14.0 软件对共有成分做OPLS-DA 分析筛选变量投影重要性（variable importance projection，VIP）值＞1 的潜在差异成分。

2.2 电子鼻分析

采用直接顶空进样法进行测定。称取金银花供试品粉末1.0 g，置于100 mL 烧杯中，使药材粉末平铺于烧杯底部，双层封口膜封口，室温静置30 min，上机测试。采样间隔1 s，清洗60 s，零点调整10 s，预采样5 s，测试120 s，进样体积流量300 mL/min。每批金银花称量3 份，平行测定3 次，取平均值进行数据分析。电子鼻各传感器详细信息见表2。

表2 电子鼻传感器阵列性能Table 2 Array performance of electronic nose sensor

2.3 电子舌分析

称取金银花供试品粉末1.0 g，置于100 mL 锥形瓶中，加入100 mL 纯净水，超声提取10 min 后，转速4 000 r/min 离心5 min，取上清液于电子舌专用样品杯中上机测试。将原始数据在电子舌自带数据处理软件中转化为味觉值后导出进行分析。电子舌各传感器详细信息见表3。

表3 电子舌传感器阵列性能Table 3 Array performance of electronic tongue sensor

2.4 不同产地金银花样品的HS-GC-MS 分析

2.4.1 总体差异分析 采用HS-GC-MS 测定3 个产地金银花样品的挥发性成分，以HB-1、HN-1、SD-1样品为例，总离子流图见图1。如图2 进行PCA（PC1: 0.392，PC2: 0.175），可以看出3 个产地的金银花样品各聚为一群，河北和山东地区的金银花挥发性成分较相似，与河南地区挥发性成分差异较大。从3 个产地中共鉴定出挥发性成分73 种（表4），其中共有成分26 个。

图1 金银花挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of Lonicerae Japonicae Flos

图2 不同产地金银花PCA 得分图Fig.2 PCA score plot of Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas

表4 不同产地金银花挥发性成分鉴定结果Table 4 Results of volatile components of Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas

2.4.2 差异挥发性成分筛选 将金银花样品所有挥发性成分整合后导入SIMCA-P 14.1 软件进行OPLS-DA，主成分特征值及方差贡献率见表5。为了确定哪些挥发性成分的含量差异在区分不同产地金银花上起了重要作用，以VIP＞1、双尾t检验有统计学意义（P＜0.05）为标准筛选河南与河北、河南与山东、河北与山东的金银花的差异挥发性成分，对每个OPLS-DA 模型进行了200 次置换检验，结果说明各模型稳定性及预测能力较好，具有显著统计学意义，见图3 和表5。

图3 OPLS-DA 得分图 (A) 和OPLS-DA 模型的置换检验图 (B)Fig.3 OPLS-DA score plot (A) and Permutation test plot of OPLS-DA model (B)

表5 金银花样品多元统计分析数据Table 5 Multivariate statistical analysis data of Lonicerae Japonicae Flos samples

从河南与河北已鉴定的共有成分中筛选出符合标准的成分15 个，分别为6-甲基-1-庚醇、(E)-2-戊烯醛、己醛、戊酸甲酯、4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、庚醛、己酸甲酯、苯甲醛、辛醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、1-辛醇、壬醛、丁香醛（异构体）、萘；从河南与山东已鉴定的共有成分中筛选出符合标准的成分11 个，分别为2-乙基-1-戊醇、己醛、(E)-2-己烯醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、庚醛、苯甲醛、2-戊基呋喃、辛醛、壬醛、丁香醛（异构体）；从河北与山东已鉴定的共有成分中筛选出符合标准的成分13 个，分别为2-乙基-1-戊醇、6-甲基-1-庚醇、(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、己醛、戊酸甲酯、(E)-2-己烯醛、己酸甲酯、(E)-2-庚醛、2-戊基呋喃、(E,E)-2，4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、丁香醛。差异性挥发成分详细信息见表6。其中3 个产地中含量均有显著差异的共有差异性挥发成分有2 个，为己醛和丁香醛（异构体）。

表6 差异挥发性成分筛选结果Table 6 Screening results of differential volatile components

2.5 电子鼻结果

对不同产地金银花各样本电子鼻传感器响应值进行数据分析。如图4-A 进行PCA（PC1: 0.644，PC2: 0.159）分析，河北金银花可与山东和河南的区分开，山东和河南大致可分开，但是有重叠部分，说明河北金银花的气味与山东与河南的不同，而山东与河南金银花的气味有相似之处。由雷达图（图4-B）可知，传感器W5S、W1S、W1W、W2W 有明显响应，即来自这3 个产地的金银花中含有较多的氮氧化合物、短链烷烃、无机硫化物、芳香成分和有机硫化物，这5 类化合物也是造成不同产地金银花气味产生差异的重要因素。

图4 不同产地金银花电子鼻分析Fig.4 E-nose analysis of Lonicerae Japonicae Flos of different producing areas

由图4-C 可知，河南金银花W5S、W1S 和W1W传感器的响应最高，说明河南金银花中含有较多的氮氧化合物、短链烷烃和无机硫化物；山东金银花与河南的金银花W2W 传感器的响应强度相似，说明两者中芳香成分和有机硫化物含量相似；河北因金银花4 个传感器的响应均最低，说明其氮氧化合物、短链烷烃、无机硫化物、芳香成分和有机硫化物含量均较少。

2.6 电子舌结果

以参比溶液的输出为味觉零点又称无味点，因参比溶液中含有少量的酸和盐，故酸味和咸味的无味点分别为−13 和−6，其他无味点均为0。

如图5-A 对不同产地金银花各样本味觉值进行PCA（PC1: 0.468，PC2: 0.254），3 个产地的金银花样品各聚为一组，说明电子舌可对不同产地金银花进行较好的区分且3 个产地金银花的味道有明显区别。由雷达图（图5-B）可知，3 个产地金银花均具有明显的苦味、涩味、鲜味和甜味，这4 种味道也是造成不同产地金银花味道产生差异的重要原因。由分组差异柱状图可知（图5-C），山东金银花的苦味、涩味、鲜味较明显，河南金银花的涩味、鲜味、甜味较弱，河北金银花的苦味较弱，山东和河北金银花的甜味相当。据结果推测山东金银花各味道较明显，滋味更浓郁丰富；河北金银花苦味、涩味较低，甜味较高，更适口；河南金银花的味道整体较淡。

图5 不同产地金银花电子舌分析Fig.5 E-tongue analysis of Lonicerae Japonicae Flos of different producing areas

2.7 不同产地金银花样品气味与化学成分关联分析

通过电子鼻的结果发现W1C、W5S、W2S 和W1W 是响应较强的传感器。为了更好地了解电子鼻传感器与差异挥发性成分之间的关系，使用筛选出的所有差异性挥发成分（共21 个）与电子鼻4 个响应较强的传感器进行pearson 相关分析。图中红色越深，表明正相关越强，即当这些化合物的含量增加时，相应电子鼻传感器的响应更强，蓝色越深则反之。

分析结果表明，4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、苯甲醛、辛醛、1-辛醇、壬醛、丁香醛（异构体）、萘与W1C、W5S、W2S 和W1W 的响应值均呈较强正相关。(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、戊酸甲酯、乙酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮与W1C、W5S、W2S 和W1W 的响应值均呈较强负相关。结合电子鼻各传感器的属性，确定了区分41 批金银花气味差异的物质基础主要为1-己醇、苯甲醛、辛醛、1-辛醇、壬醛、丁香醛（异构体）、萘、(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮（图6）。

图6 电子鼻主要响应传感器与差异挥发性成分的关联性分析Fig.6 Correlation analysis of main response sensors of Enose with differential volatile components

2.8 不同产地金银花味道判别分析

为实现对新金银花样本产地的预测，使用SPSS25 对35 个金银花样本建立判别模型，并对HB3、HB6、HN3、HN9、SD3、SD9 号金银花样品的测试结果进行判别验证。其分类函数分别为Y1＝1.940X1＋2.326X2＋0.676X3－6.983X4＋0.894X5＋5.307X6＋0.459X7－41.033，Y2＝−1.443X1＋1.157X2＋1.447X3－4.367X4＋0.990X5＋1.214X6＋1.193X7－18.940。判别结果显示（表7），其对河北、河南、山东金银花能进行有效的判别，判别识别率为100%。

表7 不同产地金银花分类结果Table 7 Classification results of different Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas samples

3 讨论

中药材的品质与产地密切相关，金银花独特的“气”和“味”是其重要特征，对药材的辨识具有重要的参考价值，且金银花中含有的多种挥发类成分，是其具有抗菌功能的物质基础[6]。基于此，本文尝试从挥发性成分、气味和味道多个角度结合多元统计分析，探讨不同产地的金银花的差异。

通过HS-GC-MS 分析、OPLS-DA 和单因素方差分析筛选出己醛和丁香醛（异构体）为3 个产地共有的差异挥发性成分，醛类一般具有青香、果香和甜香，可对总体特征风味起产生影响[7]，而己醛和丁香醛均有怡人的果香[8-9]。甜味属里甜香、花香、果香的增强，可起到掩盖和弱化苦味的效果[14]。因此可以通过进一步实验评估己醛和丁香醛是否可以作为评价金银花风味和质量的指标性成分。与传统的人工鼻闻和口尝的评价方式相比，电子鼻和电子舌具有重复性好、数据电子化、便于描述等优点，可以对气味和味道进行科学定量的评价[10-11]，近年来已被应用于多种中药的研究。研究结果显示电子鼻和电子舌均能对不同产地的金银花进行良好的区分，说明产地的不同会使金银花样品风味产生较大差异。在未来，智能感官技术在中药研究方面的应用将会更加广泛和全面。

本研究采用HS-GC-MS、电子鼻和电子舌技术结合PCA 及OPLS-DA 对不同产地金银花的挥发性成分、气味和味道差异进行研究，为金银花产地鉴别及质量评价提供了参考，对规范金银花市场具有一定指导意义。但对以上差异形成的具体原因，本文未深入探究，后期可对不同产地金银花间的差异与产地环境的相关性展开深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突