基于COI 条形码的市售蝉蜕及其混淆品DNA 分子鉴定研究

张欢欢，徐金娣，周 静，贾聪玲，吴啟南，郭梦斐，沈纪晨，伍城颖，李松林*，毛 茜*

1.南京中医药大学附属中西医结合医院 中药质量研究室，江苏 南京 210028

2.江苏省中医药研究院/中国中医科院江苏分院 中药代谢组研究室，江苏 南京 210028

3.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

蝉蜕为黑蚱CryptotympanapustulataFabricius，若虫羽化时蜕下的皮壳，是我国重要的虫类动物类药材，在我国已有近两千年的临床应用历史[1-3]。具有疏散风热、利咽透疹、平喘等功效，临床常用于风热感冒、咽痛音哑、咳喘等症[4-6]。

蝉蜕不仅是医院药房常用的中药材，也是众多中药制剂的重要原料，如苏黄止咳胶囊、黄氏响声丸、克感利咽口服液、开喉剑喷雾剂等经典中成药均以蝉蜕为原料。蝉蜕疗效明确，临床使用量逐年攀升。但蝉蜕为野生动物资源，随着森林覆盖面积的减少，其法定基原动物黑蚱的自然栖息地也日益缩减，使得蝉蜕药材资源逐年减少，市场价格居高不下，各地药材市场中也出现了较多蝉蜕混淆品和习用品。根据文献报道和课题组前期对蝉蜕全国药材市场的调研，发现当前蝉蜕基原动物除《中国药典》规定的黑蚱外，华南蚱蝉、鸣蝉、蟪蛄等多种蝉的皮壳也作为蝉蜕药用[7]。不同品种蝉蜕外观性状多相似，难以根据主观经验从性状上进行准确辨别，且蝉蜕质轻，易碎，经采收、运输等环节后，皮壳因挤压常出现破碎，难以鉴别。因此，对蝉蜕药材及其混淆品进行快速准确地鉴定，将对保障蝉蜕质量和临床疗效有十分重要的应用价值。

DNA 条形码技术是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA 片段来进行物种鉴定的分子诊断技术，不依赖物种的形态特征和分类经验[8-12]。2013 年，陈士林研究团队在前期大量研究基础上，构建了以动物细胞色素C 氧化酶I（cytochrome oxidase I，COI）序列为核心的动物类药材DNA 条形码鉴定体系[13]。国家药典委员会已经将中药材DNA 条形码分子鉴定指南纳入《中国药典》增补本[14]，规定动物类药材的DNA条形码鉴定以COI 序列为主[13-14]。COI 在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，其DNA 序列本身很少存在插入和缺失[15]。目前，物种鉴定手段在动物类药材鉴定方面已有广泛应用[16-24]。但国内尚未有运用COI 序列鉴定蝉蜕及其混淆品的报道。

本研究利用COI序列对蝉蜕及其混淆品进行鉴别研究，结合从Genbank 所得的序列分析药材的正品与混淆品之间的遗传距离、系统发育树中物种的聚类情况，考察利用COI 序列鉴别蝉蜕与其混淆品的可行性，以期利用DNA 条形码技术为准确鉴定蝉蜕基原提供科学依据。

1 材料

1.1 样品

2020 年6 月～2023 年7 月，从全国各地收集蝉蜕商品药材及其混淆品28 批，从江苏徐州沛县黑蚱野生抚育基地、河南、山东等地自采药材17 批，由江苏省中医药研究院李松林教授依据《中国药典》[1]、《中国蝉科志》[2]和《中国药用动物志》[3]鉴定基原物种分别为黑蚱蝉蜕C.atrataFabricius.、震旦大马蝉蜕MacrosemiapieliKato、南蚱蝉蜕C.holstiFabr.、阳明山螗蝉蜕TannasozanensisKato。另从江苏徐州沛县黑蚱养殖基地收集不同树种蝉卵样品5 份，用于基原确认及实验阳性对照。凭证样本和数字影像信息保存于江苏省中医药研究院中药质量和代谢组研究室，实验材料信息见表1、2。从GenBank 数据库中下载了相关的COI 序列共22 条，信息见表3。

表1 市售蝉蜕药材信息Table 1 Information of commercial Cicadae Periostracum

表2 自采蝉蜕药材信息Table 2 Information of self-harvested Cicadae Periostracum

表3 GenBank 下载的COI 基因序列信息Table 3 Information of COI gene sequences downloaded from GenBank

1.2 仪器

LEGEND MICRO21R 型高速离心机（美国Thermo 公司）；ABI PCR 仪（美国Applied Biosystems公司）；DYY-6C 型琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Gel Doc XR 型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；IKA-HB10 型水浴锅（南京科尔仪器设备有限公司）。

1.3 试剂

琼脂糖凝胶粉（擎科生物有限公司，TSINGKE TSJ001）；染料（翌圣生物有限公司，Yea Red Nucleic Acid Gel Stain 10000X in water）；聚合酶（Vazyme，2×Rapid Taq Master Mix）；引物（生工生物工程有限公司合成）；5 000 bp DNA 相对分子质量标准Marker（批号B500351，生工生物工程有限公司）；Zeup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒（批号B518251，生工生物工程有限公司），血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（批号DP304，天根生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 蝉蜕基因组DNA 提取

取出蝉蜕样品，依次用水、70%乙醇洗去附着的泥沙等杂质，置于通风橱晾干后放入研钵，使用液氮快速进行研磨，使组织充分破碎呈粉末状，后续提取DNA 步骤按照基因组DNA 提取试剂盒提取各样品总DNA，提取过程中蝉卵样品水浴1 h，蝉蜕样品较难裂解，水浴时间适当延长至3～4 h。

2.2 COI 基因的PCR 扩增

依据《中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则》，采用 COI 通用引物（ LCOI490: 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 与 HCO2198: 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ） 和COI 序列药典扩增程序（94 ℃、1 min；94 ℃、1 min，45 ℃、5 min，72 ℃、1.5 min，5 个循环；94 ℃、1 min，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1 min，35 个循环；72 ℃、5 min）进行PCR 扩增。20 μL PCR 体系中包括PCR Master Mix 10 μL，引物LCOI490 与HCO2198 各0.8 μL（10 μmol/L），DNA 2 μL 以及无菌水6.4 μL。

2.3 琼脂糖凝胶电泳及测序

用电子天平称取0.5 g 琼脂糖粉，置于装有50 mL 1×TAE 溶液的锥形瓶中，用微波炉加热至完全溶解，冷却片刻后加入5 μL 染料，摇晃至充分混匀，倒入胶槽等待其完全冷却凝固。取3 μL PCR 扩增产物和DNA Marker 在1%的琼脂糖凝胶中电泳分离，电泳仪电压设置160 V，时间25 min。在凝胶成像系统中拍照并保存，以确定COI 目的序列被准确扩增。PCR 产物进行双向测序，测序工作委托生工生物工程有限公司完成。本实验所得序列均已上传至NCBI 数据库，登录号见表4。

表4 黑蚱种内变异位点情况Table 4 Intraspecific mutation sites in C.atrata

表4 样品序列NCBI 登录号Table 4 NCBI accession numbers of experimental sample sequences

2.4 序列数据的拼接及分析

利用DNAMAN 和SnapGene 软件对测序所得序列及测序峰图进行检查，校正及拼接，然后在NCBI 中运用Blast 程序进行相似性检索，以确定基因片段的准确性并进行物种鉴定，保留相同长度的同源序列用于后续遗传分析。利用MEGA 11.0 和DnaSP6 软件统计分析黑蚱种内变异位点、碱基组成情况及蝉蜕相对于混淆品的标志性位点。将确定的序列以及GenBank 下载的22 个蝉科（Cicadidae）物种的序列用MEGA 11.0 软件基于ClustalW 算法进行多序列比对，整理所得数据，分析序列类型，计算和分析种内和种间的K2P 遗传距离。选择带栎角蝉Platycotisvittata作为发育树的外类群，利用邻接法（neighbor-joining method，NJ），选择K2P 遗传距离模型，同时采用Bootstrap 重复抽样1 000 次用以检验分子系统树各分支的置信度，对所有序列构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 DNA 提取及PCR 扩增

首先对从徐州黑蚱养殖基地不同树种上随机采集的5种蝉卵样品进行了DNA鉴定分析，蝉卵DNA提取质量浓度较高，可达500～1 000 ng/μL，PCR 扩增均可成功扩增出目的条带，不同树种蝉卵均鉴定为黑蚱，确定了徐州养殖基地的蝉蜕原动物品种为药典规定基原品种黑蚱，见图1。

图1 蝉卵样品形态及PCR 扩增结果Fig.1 Morphological diagram of cicada eggs and the results of PCR amplification

后续使用蝉蜕样品进行实验，以蝉卵样品L3 作为阳性对照。蝉蜕DNA 提取结果显示（图2），提取的蝉蜕样品DNA 质量浓度大多在20～40 ng/μL，扩增后少部分样品出现扩增失败的现象，但总体上大多数样品可成功扩出目的条带，将扩增成功样品送至生工公司测序，本实验共获得蝉蜕样品DNA 序列45 条。

图2 各样品PCR 扩增结果Fig.2 Results of PCR amplification of each sample

3.2 黑蚱单倍型分析及标志性位点分析

黑蚱的34 条种内序列，其序列长度为658 bp，所有位点中，A、G、C 和T 碱基平均含量分别为26%、16.7%、13.9%和43.4%，GC 含量为30.1%～30.8%，平均GC 含量为30.6%，A＋T 含量明显高于G＋C 含量，表现为明显的A＋T 碱基偏嗜，符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征[25]。序列分为11 个单倍型（A1～A11），A3 为主要单倍型，有16 个样品。序列共638 个保守位点，20 个突变位点（15 个简约信息位点，5 个单突变位点），其转换/颠换值为5.67，变异位点详细情况见表4。黑蚱单倍型多样性（Hd）为0.761 1，核苷酸多样性（Pi）为0.008 51，意味着本实验黑蚱种群是由多个地方种群混合而成的大而稳定的群体（单倍型多样性以0.5 为临界值，核苷酸多样性以0.005 为临界值，二者的值越大，群体的多样性程度越高）[20]。

对黑蚱的11 个单倍型序列以及混淆品序列进行比对分析并筛选黑蚱序列的标志性位点，统计出黑蚱的标志性位点共有9 处，分别位于黑蚱序列的第136、157、169、312、322、352、424、514、532 bp 处，其中，在136 bp 与157 bp 处，黑蚱所有序列的碱基均为C，而混淆品序列的碱基均为T；在312 bp 处，黑蚱碱基为A，而混淆品序列碱基均为G。在这9 处位点中，黑蚱的所有单倍型序列一致并与所有混淆品序列不同，可考虑作为黑蚱的标志性位点与其他混伪品区分，详细位点信息见表5。

表5 黑蚱标志性位点情况Table 5 Iconic sites in C.atrata

3.3 K2P 遗传距离分析

基于K2P 双参数模型的黑蚱种内种间遗传距离见表6，对不同种类蝉蜕样本进行分析，显示种内遗传距离0～0.018 4，平均0.006 1，种间遗传距离0.077 7～2 383，平均0.190 5，种间平均遗传距离是种内的31.18 倍，种内最大遗传距离远小于种间最小遗传距离，能形成一定的DNA 条形码间隙。其中中华螓蝉和绿草蝉种间遗传距离最大，为0.238 3，南蚱蝉和带蚱蝉种间遗传距离最小，为0.077 7，均大于Hebert 等[26]所推荐的物种鉴定最小种间距离0.020，显示各自在分子水平已达到种级水平的分化。

表6 黑蚱及其混淆品种群内 (对角线值) 及种群间遗传距离Table 6 Genetic distance within (diagonal value) and among populations of C.atrata and its adulterants

3.4 系统发育树的构建

利用NJ 法构建的系统进化树如图3，从NJ 树图可以看出，10 种蝉类主要形成3 个类群，类群Ⅰ包括黑蚱（GP-1）、南蚱蝉（GP-3）、带蚱蝉（GP-5）和中华螓蝉（GP-8），黑蚱与南蚱蝉和带蚱蝉亲缘关系较近，聚为一支，且进化地位较高，位于进化树上部，置信度为99%，其中南蚱蝉和带蚱蝉以78%的置信度聚为一亚支。类群II 包括蒙古寒蝉（GP-9）、松寒蝉（GP-6）、震旦大马蝉（GP-2）和阳明山螗蝉（GP-4），其中蒙古寒蝉与松寒蝉以高支持率（93%）聚为姐妹分支，显示亲缘关系较近。类群III 包括蟪蛄（GP-7）与绿草蝉（GP-10），其与黑蚱及其他几种蝉类亲缘关系较远。物种之间可明显分开，可以清晰地区分黑蚱及其混淆品和近缘种，说明该段序列能够作为黑蚱分子鉴定的依据。

图3 基于COI 序列构建的蝉蜕及其混淆品的NJ 树Fig.3 NJ tree of C.atrata and its adulterants based on COI gene sequence

4 讨论

近年来蝉蜕的临床应用范围日益扩大，但当前蝉蜕品种混乱，《中国药典》中仅有性状描述，难以准确鉴定。现有蝉蜕的鉴定研究局限于性状、显微鉴定，如牛跃华等[27]对浙江产蝉蜕和三种近缘种蝉蜕进行了性状比较研究，并系统地总结了性状特征。苑冬敏等[28]以动物药残留毛的显微特征，如刚毛的直径、长度、毛窝直径等参数为依据，对中药蝉蜕及其易混淆品进行了鉴别。郭利霄等[29]运用3D景深合成技术，从蝉蜕样品喙的长短，上、下唇突出的程度及其上横沟的颜色、足部主刺和侧刺的数量等方面对50 批蝉蜕及其混淆品样品进行鉴别。传统性状鉴定方法依赖主观经验，对鉴定人的专业素质要求较高，且培养周期长；显微鉴定在近缘种动物药材鉴定上存在一定局限性。因此，基于COI条形码的DNA 分子鉴定技术以其准确、快速鉴定物种的特点，在众多动物类药材与其混伪品的鉴别研究中，如蛇蜕、梅花鹿皮、穿山甲、龟甲，展现出了优良的鉴定能力。但国内尚未有运用COI 序列鉴定蝉蜕与其混淆品的相关报道。

蝉蜕采收后需干燥保存，且药材多附着泥沙等杂质，存储过程中表面易发生虫蛀或霉变，导致提取的DNA 浓度较低，提取困难。获取高质量DNA是DNA 分子鉴定的基础[30]。刘旭朝等[31]通过对动物药材DNA 提取方法进行优化，使用优化的裂解液配方，实现了对蝉蜕等提取困难样本DNA 的提取。但本研究发现，使用SDS 法自配试剂提取DNA有一定的局限性，比如在用乙醇洗涤DNA 沉淀时，由于蝉蜕DNA 含量较低，常常看不到沉淀产生或者沉淀较少，在吸去液体时容易造成DNA 损耗，使得提取DNA 效率很低。为得到优良的DNA 模板，本研究反复实验及优化调整，发现提取DNA 时应选择无虫蛀、无霉变的药材；并对蝉蜕进行样品前处理，依次用水、75%的乙醇清洗表面，尽量去除泥沙等杂质；研磨应迅速、充分，研磨的越细越有利于消化；取样量适当（20～30 mg，不宜过多或过少）；水浴时间延长至3 h 及以上，使细胞充分裂解释放DNA；将原有试剂盒中洗涤的操作重复1次，可更好去除蛋白质。

本研究运用COI 通用引物，优化DNA 提取过程，成功扩增出45 批蝉蜕正品及混淆品COI 条形码序列。K2P 遗传距离分析表明黑蚱种间平均遗传距离是种内的31.18 倍，种内最大遗传距离远小于种间最小遗传距离，能形成一定的DNA 条形码间隙。NJ 树结果表明黑蚱及其他几种蝉类亲缘关系较远，物种之间可明显分开，表明COI 序列针对黑蚱和混淆品的区分有效。由此可见，基于COI 序列的DNA 条形码技术能高效、准确地鉴别中药材蝉蜕及其混淆品，可有效保障蝉蜕药材质量及其临床有效性。在NJ 树结果分析中还发现，黑蚱聚为一类，其中大部分江苏产地的黑蚱样品序列在同一亚支，河南、山东等产地的黑蚱样品序列分别聚在另一亚支，呈现了依产地聚类的趋势，表明黑蚱的不同地理种群可能存在差异性。后续将继续收集各产地的样本，进一步对黑蚱的遗传多样性进行分析研究。

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