基于网络药理学与分子对接技术探讨宁脂胶囊治疗高脂血症的作用机制

谢 昊，李耀洋，赵 彬，杨 丹，吴群励*

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1. 药剂科；2. 中医科，北京 100730

高脂血症,又称血脂异常,通常指血清中胆固醇(cholesterol, CH)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平升高,高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平降低。临床上将高脂血症分为高CH血症、高TG血症、混合型高脂血症和低HDL-C血症。2018年全中国调查结果显示,≥18岁成人血脂异常总患病率为35.6%[1]。高脂血症是冠心病等动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)重要且独立的危险因素,在中国超过一半的心血管疾病负担由动脉粥样硬化所致[2]。面对ASCVD疾病负担不断上升的趋势,血脂管理刻不容缓[3]。

宁脂胶囊(原为降脂中药片),是北京协和医院中医科梁晓春根据其多年临证经验而研创的院内制剂,主要由何首乌、荷叶、姜黄、决明子、蒲黄、太子参、郁金、泽泻组成[4]。临床研究与动物实验均证实宁脂胶囊具有良好的降血脂作用[4-6]。然而,宁脂胶囊的关键药物、关键成分、关键靶点及信号通路尚不明确。中药成分复杂,传统的“一个药物、一个靶点、一种疾病”的药理学思路不符合中药作用机理。网络药理学是融合系统生物学、生物信息学、网络科学等的交叉学科,从系统层次和生物网络的整体角度,解析药物与疾病之间的分子关联,可解释中药多成分、多靶点的协同作用,其研究理念与中医药学整体论思想相符。此外,分子对接是研究小分子与靶点间相互作用的模拟计算方法,通过结合能及氢键数量可进一步验证中药小分子与靶点的结合活性。本文利用网络药理学与分子对接技术,分析宁脂胶囊的关键药物及其关键成分,探索其治疗高脂血症的潜在药理靶点,旨在为该方的临床应用及后续深入基础研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物成分靶点库建立

使用以下检索词,检索BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.

php/),获取宁脂胶囊组成药物的成分及预测靶点:“HE SHOU WU” “HE YE” “JIANG HUANG” “JUE MING ZI” “PU HUANG” “TAI ZI SHEN” “YU JIN” “ZE XIE”。筛选相似性模型阈值score cutoff≥20的预测靶点并整理,建立药物成分靶点库。

1.2 高脂血症靶点库建立

以“hyperlipidemia”为关键词,检索DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org)与GeneCards数据库(https://www.genecards.org),获取高脂血症相关靶点。DisGeNET数据库中以“score_gda”,GeneCards数据库中以“relevance score”作为靶点与疾病的相关性评分。筛选两个数据库中相对分≥0.10的靶点,合并、去重并整理(白蛋白除外),建立高脂血症靶点库(score_gda相对分=score_gda/score_gda最高值;relevance score相对分=relevance score/relevance score最高值)。

1.3 潜在药理靶点获取

使用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)工具,获取药物成分靶点库与高脂血症靶点库的共同靶点,并构建韦恩图。共同靶点即为宁脂胶囊降脂的潜在药理靶点,相关成分即为潜在药理成分。选取“score_gda相对分”与“relevance score相对分”两者中的高值,作为潜在药理靶点的相对分。

1.4 蛋白质-蛋白质互作

将潜在药理靶点输入STRING数据库(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl),物种选择为人类(homo sapiens),最低相互作用阈值为0.70(高置信度),获取蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)分析结果。

1.5 基因本体论及通路富集分析

将潜在药理靶点输入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov),物种选择为人类,靶点名称为官方基因名称(official_gene_symbol),获取基因本体论(gene ontology,GO)与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析结果,P<0.05作为筛选标准。基因本体论分析包括:生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)。

1.6 分子对接验证

从PDB蛋白质结构数据库(https://www. rcsb.org)获取靶点的3D结构.pdb格式文件(选择分辨率更高的结构),使用PyMOL2.5.5去除其中的配体(如果含有)及非蛋白质分子(如水分子)。使用ZINC数据库(https://zinc.docking.org)获取药物成分的ZINC编码。将.pdb格式文件上传SwissDock在线分子对接网站(http://swissdock.ch)作为受体,并输入成分的ZINC编码作为配体,进行分子对接,获取结合能(blinding energy)数据。一般认为结合能<-4.25 kcal/mol表示配体小分子与受体蛋白之间有一定的结合活性;结合能<-5.00 kcal/mol表明二者之间有较好的结合活性;结合能<-7.00 kcal/mol表明配体与受体具有强烈的结合活性。

2 结果

2.1 潜在药理靶点

从BATMAN-TCM数据库获得宁脂胶囊组成药物的185个结构已知的成分,靶点预测获得1 432个score cutoff≥20的靶点。从DisGeNET数据库检索得471个高脂血症相关靶点(hyperlipidemia,C0020473),以score_gda相对分≥0.10标准筛选最终获得72个靶点。从GeneCards数据库检索得2 105个高脂血症(hyperlipidemia)相关靶点,以relevance score相对分≥0.10标准筛选最终获得28个靶点。将药物预测靶点与高脂血症相关靶点进行交叉映射,最终获得32个共同靶点,作为潜在药理靶点(图1,表1)。其中,载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxi-some proliferator activated receptor alpha,PPARA)高脂血症相关性评分最高。

表1 宁脂胶囊组成药物的靶点数量Table 1 Number of targets of the drugs in Ningzhi capsule

图1 药物预测靶点-高脂血症相关靶点韦恩图Fig 1 The Venn diagram of the predicted targets of drugs and hyperlipidemia related targets

2.2 药物-成分-靶点

药物的成分、预测靶点、潜在药理靶点、潜在药理成分数量见表1。郁金、姜黄、蒲黄拥有最多的潜在药理靶点,分别为17、14、14个;决明子、姜黄、郁金拥有最多的潜在药理成分,分别为16、15、11个。花生四烯酸(arachidonic acid)-蒲黄,具有最多的潜在药理靶点,为8个。其次,谷氨酸(glutamic acid)-太子参,间羟基苯甲酸(M-hydroxybenzoic acid)-蒲黄,姜黄酮(turmerone)-姜黄、郁金,具有7个潜在药理靶点。肾上腺素受体β2(adrenoceptor beta 2,ADRB2)与6种药物存在关系,此外,APOE作为与高脂血症的相关性评分最高的靶点,是郁金5种成分的预测靶点。

2.3 PPI分析

通过STRING数据库,在最低相互作用阈值为0.70的标准下,获得32个靶点76条相互作用数据(6个靶点无相互作用),PPI富集P值小于1.0×10-16,平均度值为4.75(度值表示与某靶点相互作用的其他靶点数量)。该结果表明这些蛋白质,作为整体,至少是部分地生物学上相连接。APOE的度值最高,与其相互作用的其他靶点数量最多,为15个,此外APOE与高脂血症的相关性评分也最高,提示APOE-郁金可能是重要靶点。胰岛素(insulin,INS)、白介素6(interleukin 6,IL6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、瘦素(leptin,LEP)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARA)的度值大于9,分别为14、12、12、10、10。

2.4 GO与KEGG通路富集分析

通过GO与KEGG通路富集分析,获得显著富集的181个BPs、19个CCs、25个MFs、23个KEGG通路(P<0.05)。RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)与基因表达的正向调控(positive regulation of gene expression)是涉及靶点数最多的BP,提示宁脂胶囊可能通过调节DNA转录,影响基因表达从而发挥作用。此外,也可能与调节对糖皮质激素的反应(response to glucocorticoid)、对胰岛素刺激的细胞反应(cellular response to insulin stimulus)、胆固醇稳态(cholesterol homeostasis)、对乙醇的反应(response to ethanol)、葡萄糖稳态(glucose homeostasis)、MAPK级联的正向调控(positive regulation of MAPK cascade)、对低氧的反应(response to hypoxia)有关。富集的KEGG通路中,许多通路与高脂血症有关,如:非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、胆固醇代谢(cholesterol metabolism)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)。APOE、NOS3、PPARA分别是胆固醇代谢、cGMP-PKG、PPAR信号通路的关键蛋白质。此外,ATP结合盒亚家族A成员1(ATP binding cassette subfamily A member 1,ABCA1)-蒲黄、载脂蛋白C2(apolipoprotein C2,APOC2)-蒲黄、载脂蛋白A2(apolipoprotein A2,APOA2)-何首乌、决明子、蒲黄、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)-姜黄、 决明子与APOE共同富集在胆固醇代谢信号通路;肾上腺素受体β3(adrenoceptor beta 3,ADRB3)-何首乌、姜黄、蒲黄、郁金、肾上腺素受体β2(ADRB2)-何首乌、荷叶、姜黄、蒲黄、太子参、郁金、胰岛素(INS)-何首乌、姜黄、蒲黄、郁金、泽泻与NOS3共同富集在cGMP-PKG信号通路;脂联素(adiponectin, C1Q and collagen domain containing,ADIPOQ)-蒲黄、载脂蛋白A2(APOA2)-何首乌、决明子、蒲黄、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activa-ted receptor gamma,PPARG)-何首乌、姜黄、决明子、蒲黄与PPARA共同富集在PPAR信号通路。

2.5 分子对接

APOE、NOS3、PPARA为高脂血症相关性评分最高的3个靶点,其3D结构.pdb格式文件上传至SwissDock在线分子对接网站,同时输入药物成分ZINC编码,进行分子对接,获得结合能数据,结果显示靶点与相应药物成分具有较好的结合活性(<-5.00 kcal/mol)。此外,精氨酸(arginine)-太子参、谷氨酸(glutamic acid)-太子参、四羟基紫杉二烯(tetrahydroxytaxadiene)-何首乌与NOS3,花生四烯酸(arachidonic acid)-蒲黄与PPARA,结合能绝对值较低且有氢健形成。

3 讨论

临床研究显示,宁脂胶囊治疗高脂血症患者总胆固醇(total cholesterol, TC)的总有效率为68.8%,TG的总有效率为83.9%,可升高HDL-C,降低动脉硬化指数,改善血液流变性[5]。动物实验研究亦证实宁脂胶囊可显著改善大鼠的血脂谱,且与血脂康相比差异无统计学意义[6]。虽然宁脂胶囊的降脂效果已被证明,但其作用机制尚不明确。本研究结果显示,宁脂胶囊的潜在药理成分较多(如:花生四烯酸、间羟基苯甲酸),它们可能通过影响多个核心靶点(如ADIPOQ, APOA2, PPARG, PPARA),作用于血脂相关信号通路(如PPAR信号通路),发挥降脂作用。

宁脂胶囊药味组成中,姜黄和郁金降脂的潜在药理成分和靶点较多。姜黄属(CurcumalongaL.)植物的根茎是“姜黄”来源,块根是“郁金”来源,二者相似。研究发现,姜黄可以显著降低血浆中TC,TG,LDL-C浓度,升高HDL-C/LDL-C比值,预防高脂饮食小鼠血浆内鞘脂类化合物的异常升高[7]。花生四烯酸具有最多的潜在药理靶点。花生四烯酸与糖脂代谢密切相关,可通过调节肝脏中与脂质代谢相关的基因来改善脂质代谢[8]。

APOE、NOS3、PPARA作为高脂血症相关性评分最高的3个靶点,蛋白质互作较多,可能是宁脂胶囊发挥降脂作用的关键靶点,在未来中药降脂相关基础研究中,其可作为优先探索的对象。APOE,介导脂蛋白与特定细胞表面受体结合,在调节脂蛋白从血浆清除方面发挥关键作用[9]。分子对接结果提示郁金可能通过作用于APOE,增强血脂的清除,KEGG通路富集结果显示,何首乌、姜黄、决明子、蒲黄可能与郁金共同作用胆固醇代谢信号通路,降低血CH水平。NOS3,产生一氧化氮,可能通过cGMP-PKG信号通路在高脂血症个体中上调LDL受体,控制血脂水平[10]。太子参、何首乌可能作用于NOS3发挥作用,荷叶、姜黄、蒲黄、郁金、泽泻可能与其共同作用cGMP-PKG通路发挥,加强降脂效果。PPARA,参与调节各种外周组织的脂肪酸氧化[11]。PPARA激动剂在人体中有稳定的降脂效果,目前临床应用的许多降脂药物为PPARA的激动剂:非诺贝特(fenofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、氯贝丁酯(clofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)。蒲黄可能通过激动PPARA,增强脂肪酸氧化,何首乌、姜黄、决明子可能与其共同作用PPAR通路,降低TG水平。

综上所述,本研究通过网络药理学与分子对接技术揭示了郁金、姜黄、蒲黄、决明子是宁脂胶囊降脂的关键药物,APOE、NOS3、PPARA可能是其降脂的关键靶点,宁脂胶囊可能通过调节胆固醇代谢、cGMP-PKG、PPAR等信号通路,促进血脂的清除,发挥降血脂作用。本研究是基于网络药理学与分子对接技术的初步机制研究,未考虑药物成分含量高低,所筛选出的靶点需进一步实验验证,后续课题组将以此为基础开展深入研究。