紫茉莉种子中对草地贪夜蛾的杀虫活性成分及杀虫机制

詹 丽, 李敬丹, 付 璇, 梁宗锁, 梁 倩

(1.西南林业大学林学院,云南 昆明 650224; 2.浙江理工大学绍兴生物医药研究院,浙江 绍兴 312000)

草地贪夜蛾(SpodopterafrugiperdaJ.E.Smith)属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属(Spodoptera)昆虫,主要寄主为玉米[1],是一种重大农业害虫[2]。2019年,中国多个省份发生草地贪夜蛾入侵,对玉米和甘蔗危害面积超过5×106hm2[3],给农业生产带来了巨大威胁。近年来,虱螨脲、除虫脲、乙基多杀菌素和溴氰虫酰胺等多种杀虫剂在防治草地贪夜蛾方面发挥了重要作用[4]。但是随着化学农药的使用,害虫的抗药性及环境问题日益突出,据报道草地贪夜蛾已对虱螨脲、氟胺氰菊酯和毒死蜱等41种传统及新型杀虫剂产生了不同程度的抗药性[5-6]。在尼日利亚的玉米田里,从玉米播种到收获期间,喷施11种不同剂量的药剂,玉米采收后,测定20 cm土层深度的土壤样品中农药残留,其中氯菊酯和毒死蜱等杀虫剂对土壤中的生物和其他非靶标物种会产生有害影响[7]。因此,筛选或研发高效、安全的植物源杀虫剂是保障农业绿色生产可持续发展的重要措施。植物源杀虫剂通过不同的作用机制影响害虫的消化、神经、内分泌和呼吸系统,分子水平上一般通过作用于昆虫细胞信号通路中的某些重要靶点,干扰神经系统的信号传递(如神经递质的合成、储存、释放、结合和再摄取等)或阻断生物代谢途径而发挥杀虫活性[8]。利用植物杀虫活性成分制成的杀虫剂,具有无污染、作用方式多样、易降解、低毒且不易产生耐药性等特点[9],是未来害虫防治中很有潜力的化学农药替代品。

紫茉莉(MirabilisjalapaL.)原产于南美,具有耐贫瘠、生长迅速、适应能力和繁殖能力强等生物特征,中国很多地区都有栽培[10]。研究发现10 mg/ml紫茉莉全草乙醇提取物对二斑叶螨(Tetranychusurticae)雌成螨24 h时触杀活性的校正死亡率为76.5%,第5 d对二斑叶螨卵的触杀活性的校正死亡率为33.7%[10]。紫茉莉叶与茎提取物对4龄尖音库蚊(Culexpipiens)幼虫触杀活性的LC50分别为6.84 mg/ml和3.98 mg/ml,对成虫熏蒸活性的LC50分别是0.14 mg/ml和0.27 mg/ml[11]。紫茉莉叶提取物浓度为0.8 g/ml时与白僵菌(Beauveriabassiana)混合使用,会使甘蓝薄翅螟(Crocidolomiapavonana)化蛹时间延长、蛹质量减轻、化蛹率降低及死亡率增加[12]。紫茉莉叶提取物质量浓度为0.8 g/ml时与绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)混配处理甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)可破坏甜菜夜蛾的免疫系统,48 h甜菜夜蛾的死亡率达到76%[13]。但目前针对紫茉莉种子中对草地贪夜蛾的杀虫活性成分及杀虫机制的研究未见报道。

本试验基于前期紫茉莉种子各萃取物对草地贪夜蛾的触杀、胃毒和拒食活性筛选,发现石油醚萃取物的触杀活性最好[14]。因此以触杀活性为依据进行硅胶柱层析分离和GC-MS分析,明确其活性成分,并测定活性成分对草地贪夜蛾体内3种酶活性的影响,为紫茉莉植物资源的开发利用及新型植物源杀虫剂的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物样品 紫茉莉种子于2020年9月购自云南省昆明市螺蛳湾中药材市场,种子阴干粉碎备用。

1.1.2 供试昆虫 草地贪夜蛾虫卵由河南省济源白云实业有限公司提供,在培养箱培养,温度24～26 ℃,相对湿度70%～80%,光/暗周期16 h/8 h,初孵幼虫用新鲜玉米叶喂养,选取健康、生长发育状况相同的3龄幼虫作为试验幼虫。

1.1.3 试验试剂 供试试剂和酶试剂盒:石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇购自云南利妍科技有限公司;三氯甲烷从西南林业大学易制毒管理处领取;吐温80购自天津风船化学试剂科技有限公司;十三烷(≥98%)购自上海麦克林生化科技股份有限公司;亚油酸乙酯(≥98%)、油酸乙酯(≥95%)购自上海源叶生物科技有限公司;AChE试剂盒、CarE试剂盒和Ca2+-Mg2+-ATP酶试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 紫茉莉种子石油醚萃取物硅胶柱层析分离 用薄层色谱确定硅胶柱层析分离的洗脱体系为:石油醚、石油醚∶三氯甲烷=50∶1(体积比)、石油醚∶三氯甲烷=1∶1(体积比)、三氯甲烷、三氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1(体积比)、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶甲醇=20∶1(体积比)、乙酸乙酯∶甲醇=1∶1(体积比)、甲醇。

1.2.2 GC-MS检测条件 气相色谱条件:色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序,100 ℃保持2 min, 以4 ℃/min升至250 ℃,保持10 min;载气(He)流速1.2 ml/min,进样口温度250 ℃,柱前压100 kPa,进样量0.2 ml,分流比100∶1。

质谱条件:电离方式(EI)离子源,电子能量70 eV,接口温度280 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃。电子倍增器电压1 894 V。采用wiley7n.l标准谱库检索定性。通过面积归一化法计算各化合物的相对含量。

1.2.3 20个馏分及主要化合物对草地贪夜蛾的杀虫活性 参照宋洁蕾等[15]的方法,测定馏分及化合物的杀虫活性,略有改动。20个馏分样品用0.5%吐温80水溶液分别配成10.00 mg/ml的溶液。馏分2的主要化合物用0.5%吐温80水溶液配成不同浓度梯度的溶液。将草地贪夜蛾3龄幼虫分别在不同馏分及主要化合物的溶液中浸渍5 s,用毛笔挑出放入饲养盒,每盒1头,用新鲜玉米叶片饲养,每个处理幼虫10头,重复5次。第1 d、3 d、5 d、7 d观察草地贪夜蛾并记录死亡与存活数量。根据公式(1)和(2)计算死亡率以及校正死亡率。

(1)

(2)

1.2.4 酶活性的测定方法

1.2.4.1 供试幼虫处理及酶液制备 将亚油酸乙酯配制成10.00 mg/ml、5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.25 mg/ml和0.63 mg/ml不同质量浓度的溶液,采用浸虫法处理草地贪夜蛾3龄幼虫,浸渍5 s,每个质量浓度处理10头,重复5次,0.5%吐温80水溶液处理作为对照。于处理后第7 d挑取草地贪夜蛾幼虫,称取0.1 g,按酶试剂盒说明书制备待测样本。

1.2.4.2AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的测定 具体操作分别参照AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶试剂盒说明书。根据公式(3)、(4)和(5)计算AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

=191.2×△A/W

(3)

(4)

(5)

式中: △A为读取测定管与对照管的吸光值之差;V为加入提取液的体积(1 ml);V1、V3和V5为加入样本的体积,分别为0.06 ml、0.04 ml和0.20 ml;V2和V4为反应体系总体积,分别为0.78 ml和0.68 ml;ε为TNB摩尔消光系数[13.6×103L/(mol·cm)];d为比色皿光径(1 cm);W为样本质量(g);T1,T2,T3为反应时间,分别为5 min、3 min和20 min;D为稀释倍数,若未稀释则数值为1。

1.3 数据分析

数据采用Microsoft Excel进行整理,用SPSS 23.0软件进行分析,计算草地贪夜蛾的半数致死浓度LC50、95%置信区间、卡方、酶活性的平均值和标准差,用Origin软件绘图。

2 结果与分析

2.1 紫茉莉种子20个馏分对草地贪夜蛾的杀虫活性

由表1可知, 20个馏分用10.00 mg/ml质量浓度处理草地贪夜蛾后,馏分2第1 d、3 d、5 d和 7 d的校正死亡率(%)均显著高于其他馏分(P<0.05),表明其具有较强的杀虫活性。

2.2 馏分2的GC-MS分析及化学成分的杀虫活性

2.2.1 馏分2的化学成分 由表2可知,紫茉莉种子馏分2的主要成分为十三烷(9.59%)、亚油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%),总含量为94.99%。

表2 馏分2的主要化学成分

2.2.2 馏分2的主要化学成分对草地贪夜蛾的杀虫活性 由表3可知,亚油酸乙酯在第1 d、3 d、5 d、7 d的半致死质量浓度(LC50)均最小,杀虫效果最好。其次为十三烷和油酸乙酯。综合比较,亚油酸乙酯杀虫效果最明显。

2.3 亚油酸乙酯对草地贪夜蛾AChE、CarE和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响

2.3.1 亚油酸乙酯对AChE活性的影响 由图1可知,不同质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾5 s后,饲养到第7 d,与对照相比,AChE活性呈现先抑制后激活再抑制的趋势。与对照相比,0.63 mg/ml和1.25 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾AChE活性显著降低(P<0.05)。0.63 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾AChE活性是对照的0.79倍,1.25 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾AChE活性是对照的0.91倍。与对照相比,2.50 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾AChE活性显著提高(P<0.05),活性是对照的1.18倍。与对照相比,5.00 mg/ml和10.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,AChE活性显著降低(P<0.05)。5.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾AChE活性是对照的0.96倍。10.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾AChE活性是对照的0.69倍。

2.3.2 亚油酸乙酯对CarE活性影响 由图2可知,不同质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾5 s后,饲养到第7 d,与对照相比,CarE活性呈现先抑制后激活的趋势。与对照相比,0.63 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾CarE活性显著降低(P<0.05),是对照的0.64倍。1.25 mg/ml、2.50 mg/ml和10.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾CarE活性显著提高(P<0.05)。1.25mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾CarE活性是对照的1.31;2.50 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾CarE活性是对照的1.50倍;5.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾CarE活性是对照的1.80倍;10.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾CarE活性是对照的1.26倍。

2.3.3 亚油酸乙酯对Ca2+-Mg2+-ATP酶活性影响 由图3可知,不同质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾5 s后,饲养到第7 d,与对照相比,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈现先激活后抑制的趋势。0.63 mg/ml亚油酸乙酯处理,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与对照相比无显著差异(P>0.05)。与对照相比,1.25 mg/ml和2.50 mg/ml亚油酸乙酯处理,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著提高(P<0.05)。1.25 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾Ca2+-Mg2+-ATP酶活性是对照的2.03倍;2.50 mg/ml亚油酸乙酯处理,草地贪夜蛾Ca2+-Mg2+-ATP酶活性是对照的1.49倍。与对照相比,10.00 mg/ml亚油酸乙酯处理,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著降低(P<0.05),活性是对照的0.65倍。

表3 馏分2的化学成分对草地贪夜蛾的杀虫活性

图中不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

图中不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

图中不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

3 讨 论

对紫茉莉种子石油醚萃取物进行柱层析分离共得到20个馏分,其中馏分2的触杀活性最好,第1 d、3 d、5 d和7 d草地贪夜蛾校正死亡率分别为74.00%、80.00%、82.00%和82.00%,与其他馏分差异显著(P<0.05)。经GC-MS分析,馏分2的主要化学成分为十三烷(9.59%)、亚油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%)。亚油酸乙酯触杀活性最好,第1 d、3 d、5 d和7 d的LC50分别为8.62 mg/ml、7.26 mg/ml、6.23 mg/ml和5.70 mg/ml。文献报道万寿菊(Tageteserecta)、曼陀罗(Dathurametel)和鸭嘴花(Adathodavassica)乙酸乙酯粗提物对草地贪夜蛾3龄幼虫第1 d的LC50分别为246.4 mg/ml、420.8 mg/ml和1 253.1 mg/ml,第3 d的LC50分别为186.7 mg/ml、295.5 mg/ml和1 118.2 mg/ml[16]。毛脉树胡椒(Piperhispidinervum)挥发油对草地贪夜蛾3龄幼虫96 h的LD50为每头277.91 μg[17](文献中的点滴量为1 μl)。姜(Zingiberofficinale)根茎正己烷提取物及分离得到的10-姜烯酚和8-姜烯酚24 h时对草地贪夜蛾2龄幼虫的LD50分别为每头18.98 μg、8.55 μg和7.68 μg[18](文献中的点滴量为1 μl)。紫茉莉种子石油醚萃取物第7 d对草地贪夜蛾3龄幼虫的LC50为6.07 mg/ml[14]。麻风树(Jatrophacurcas)种子油经柱层析分离,富含佛波酯的馏分对草地贪夜蛾24 h的LC50为0.83 mg/ml[19]。可以看出,亚油酸乙酯对草地贪夜蛾3龄幼虫的触杀活性要优于万寿菊、曼陀罗、鸭嘴花乙酸乙酯粗提物以及毛脉树胡椒挥发油、姜根茎正己烷提取物、10-姜烯酚、紫茉莉种子石油醚萃取物,但是不及8-姜烯酚和麻风树种子油柱层析富含佛波酯馏分的活性。

亚油酸乙酯对其他害虫也具有杀虫活性及引诱活性。飞燕草(Consolidaajacis)甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物对小菜蛾均具有触杀活性,乙酸乙酯萃取物触杀活性最强,经GC-MS分析,4个主要成分中亚油酸乙酯对小菜蛾的触杀活性最好,72 h的LC50为0.26 mg/ml[20]。栀子(Gardeniajasminoides)挥发油对烟粉虱(Bemisiatabaci)和二斑叶螨(Trialeurodesvaporariorum)若虫具有杀虫活性。经过GC-MS分析,其中5种主要化合物中,亚油酸乙酯对烟粉虱若虫的触杀活性最好,对二斑叶螨若虫的触杀活性仅次于杀虫活性最好的角鲨烯[21]。加拿大一枝黄花(Solidagocanadensis)地上部分石油醚萃取物对方形环棱螺(Bellamyaquadrata)24 h和48 h的LC50均优于乙酸乙酯和正丁醇萃取物,分别为1.10 mg/ml和0.23 mg/ml,石油醚萃取物经GC-MS分析,亚油酸乙酯含量最高(12.18%),认为可能是亚油酸乙酯对方形环棱螺具有杀虫活性[22]。香菜(Coriandrumsativum)等8种植物乙醇粗提物对黑肩绿盲蝽(Cyrtorhinuslividipennis)雌虫引诱率最高,达46.67%,经GC-MS分析,亚油酸乙酯含量最高,为13.52%,认为亚油酸乙酯可能对黑肩绿盲蝽具有引诱活性[23]。

广藿香酮(Pogostone)对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)幼虫体内的AChE活性变化表现为随着处理质量浓度的增高呈现先抑制后激活再抑制的趋势[24]。敌敌畏、甲氰菊酯和氯氰菊酯对中华蜜蜂(Apiscerana)体内的AChE活性呈现先抑制后激活再抑制的趋势[25]。本试验不同质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾后,第7 d时,AChE活性的变化也表现为先抑制后激活再抑制的趋势。造成这种趋势的原因可能是亚油酸乙酯与草地贪夜蛾体内AChE结合,使AChE磷酰基化,AChE活性被抑制[26]。

随质量浓度的提高,广藿香酮对斜纹夜蛾幼虫中肠CarE的活性变化表现为先抑制后激活的作用[24],甲维盐对草地贪夜蛾体内CarE活性表现为先抑制后激活作用[27],异菌脲对意大利蜜蜂(Apismellifera)体内CarE活性表现为先抑制后激活作用[28]。本试验不同质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾后,第7 d,其体内CarE活性随着亚油酸乙酯质量浓度的升高表现为先抑制后激活作用。低质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾时,由于供试害虫中毒后体内正常的代谢受到影响,间接影响了羧酸酯酶的活性[29],后又呈现激活趋势,可能是由于外源性有毒物质刺激了昆虫体内的应激免疫,从而诱导CarE活性的增加,加速了对外源性物质的解毒代谢[30]。

随质量浓度的提高,瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)根石油醚提取物对桃蚜(Myzuspersicae)体内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性表现为先激活后抑制趋势[31],丁香酚对枸杞蚜虫(Aphissp.)和枸杞木虱(Paratriozasinica)成虫Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈现低剂量激活高剂量抑制趋势。香茅(Cymbopogoncitratus)油对枸杞木虱成虫Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈现低剂量激活高剂量抑制作用。本试验不同质量浓度亚油酸乙酯处理草地贪夜蛾后,第7 d,其体内Ca2+-Mg2+-ATP酶活性随着亚油酸乙酯质量浓度的升高表现为先激活后抑制的趋势。关于低质量浓度处理下Ca2+-Mg2+-ATP酶活性被激活,可能与昆虫中毒初期表现过度兴奋的症状有关[32]。高质量浓度处理下Ca2+-Mg2+-ATP酶活性被抑制,可能因为Ca2+和Mg2+离子的跨膜平衡受到破坏,影响离子通道的开放或关闭,发生电位异常,害虫神经系统功能紊乱[33]。

4 结 论

本研究采用硅胶柱层析法分离紫茉莉种子石油醚萃取物,共得20个馏分,杀虫试验测试结果表明,馏分2对草地贪夜蛾的杀虫活性最好,经GC-MS分析,主要化学成分为十三烷(9.59%)、亚油酸乙酯(51.14%)和油酸乙酯(34.26%)。处理后第7 d,这3种主要化学成分对草地贪夜蛾的LC50分别为15.06 mg/ml、5.70 mg/ml和18.42 mg/ml,亚油酸乙酯的杀虫活性最高。随亚油酸乙酯质量浓度的增加,草地贪夜蛾3龄幼虫体内AChE活性呈现先抑制后激活再抑制的趋势,CarE活性呈现先抑制后激活的趋势,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈现先激活后抑制的趋势。