竹节参总皂苷缓解CCl4诱导的大鼠急性肝损伤：基于调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路

吴广阳，宋添力，唐 浪，王一民，刘 绪，黄 胜

湖北民族大学1医学部，3风湿性疾病发生与干预实验室，湖北 恩施 445000；2湖北恩施学院，湖北 恩施445000

急性肝损伤（ALI）是指在短期内由各种原因引起的突发性的肝功能异常的疾病。药物、病毒、免疫损伤等是ALI的发病原因；氧化应激、炎症反应、细胞纤维化、细胞凋亡等是其发病机制［1,2］。全球2/3以上的ALI发生在亚太地区［3］。近年来，急性肝损伤的发病率呈逐年上升趋势且伴有多种严重并发症，严重威胁人类的身体健康［4］。由于急性肝损伤的病理机制复杂，目前国内外尚无理想的急性肝损伤治疗方案，临床上治疗原则主要包括对因治疗、使用保肝降酶和利胆退黄药物以及最新的纳米技术［5,6］；对于严重的急性肝损伤患者，肝脏部分切除术和肝移植仍是临床上的首选诊疗手段，但存在供体不足、免疫抑制、手术预后情况较差等问题，每年接受手术的病人不到40%，在一定程度上限制了其临床应用［7,8］。近年来许多专家学者通过对急性肝损伤发病机制的不断深入研究，也逐渐把目光移向祖国传统医学，以期在中医药治疗方面有所突破，从中研发出起效快、多靶点、副作用小的抗急性肝损伤的新药，而位于恩施州的湖北民族大学附属医院经常运用民族药材竹节参治疗肝炎、肝癌等肝病，临床作用显著。因此，阐明竹节参治疗急性肝损伤的发病机制，寻找安全、疗效确切的防治急性肝损伤的新策略、新药物意义重大。

竹节参是五加科植物竹节参的干燥根茎。其性温，味甘、苦，具有补虚强壮，散瘀止血、止痛的功效，多用于素体羸弱，咳嗽痰多，风湿疼痛等疾病［9］。我国土家族地区极具特色的复方竹节参片则是以竹节参为主药，通过网络药理学分析得出，其通过作用于STAT3、JUN 和AKT1 等核心靶点，参与相关生物进程及通路的调节，进而发挥对ALI的抗氧化、抗炎、护肝等治疗作用［10］。竹节参总皂苷（TSPJ）为是竹节参的主要成分，邱玲等［11］实验研究表明竹节参总皂苷可以通过p62相关的Nrf2通路和AMPK-ACC/PPAR α轴减轻肝脂肪变性。曾楚华等［12］研究竹节参总皂苷对BV-2小胶质细胞神经炎症模型p38 MAPK/NF-κB通路的影响，发现竹节参总皂苷可通过抑制此通路以改善神经炎症，并抑制细胞迁徙。邓旭坤等［13］研究表明竹节参皂苷可能通过减少肝细胞的凋亡和炎症来抵抗APAP诱导的肝损伤。以上已有相关研究证明竹节参总皂苷在抗炎、抗氧化应激、抗凋亡方面具有一定药理作用，然而目前还没有TSPJ在干预CCl4诱导的大鼠肝损伤方面的研究和报道，尤其是在急性肝损伤中保护肝脏方面的作用机制尚需进一步研究探究［14］。

本课题组前期研究发现［15］，竹节参多糖可减轻炎性细胞因子和凋亡蛋白表达，从而对ALI 大鼠产生保护作用，其作用可能与抑制PI3K/AKT/NF-κB通路活化有关。本文通过现代生物信息学得出，竹节参皂苷对ALI具有较好的保护作用，核心通路为PI3K/Akt/NF-κB；通过文本挖掘发现在ALI疾病中，核转录因子-κB（NF-κB）被认为是关键的炎症因子。因此，本研究通过进一步分析PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白的表达水平，阐释竹节参总皂苷对CCl4致ALI的保护作用及其分子机理。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，SPF级，6周龄，体质量200±20 g，共50只，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物质量合格证编号：No.210726210100 500171；许可证号：SCXK（辽）2020-0001。动物实验方案经湖北民族大学伦理委员会批准（2021-50），所有实验程序均按照中国国家卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行。

1.2 竹节参总皂苷制备及含量测定

竹节参于湖北省宣恩县椿木营基地购买，经湖北民族大学医学院曾楚华副教授鉴定为竹节参。将200 g竹节参制成粗粉，按质量体积比1∶10比例加入60%的乙醇，浸泡2 h，然后水浴回流，回流时间2 h，过滤得滤液，重复3次，将3次滤液合并，旋转蒸发回收乙醇，减压浓缩至一定体积，配制成竹节参：浓缩液为1∶1的溶液。上已处理好的大孔树脂柱，上柱后先用水洗脱、然后用60%的乙醇洗脱。合并乙醇洗脱液，65 ℃减压干燥，得到竹节参总皂苷［16］，提取率为14.6%，用香草醛-冰醋酸-浓硫酸测定方法测定［17］，后获得29.2 g精制竹节参总皂苷，竹节参总皂苷的含量为91.81%。

1.3 主要试剂

联苯双酯（北京协和药厂）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体、白细胞介素-6（IL-6）抗体（万类生物），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）（proteintech），沉默信息调节因子6（SIRT6）、磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）抗体（abcam），磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（p-AKT）抗体（万类生物），丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT，SAB）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）抗体、核因子κB（NF-κB）抗体（万类生物）。

1.4 主要仪器

全自动生化检测仪（深圳雷杜生命科技）；多功能酶标仪（Thermo）；组织切片机（LEICA）；正置光学显微镜（Nikon）；电泳及转膜系统（Bio-Rad）；凝胶成像系统（Thermo）；高精度天平（北京赛多利斯科学仪器）；高速冷冻离心机（Eppendrof）。

1.5 竹节参治疗肝损伤的网络药理学分析

利用TCMSP、Swiss Target Prediction数据库提取竹节参的化合物组成、化合物靶点关系（以Swiss Target Prediction生物利用度评分高，胃肠道吸收高为标准）。将交集靶点导入STRING网站，得到PPI网络图，将TSV文件导入R语言V4.0.3软件，得到PPI统计图。在R语言V4.0.3 软件中安装“RSQLite”“org.Hs.eg.db”程序包，将竹节参的交集靶点名转换为对应的基因ID；利用“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，基于基因ID分别进行GO、KEGG富集分析。

1.6 动物造模及分组给药

将50只SD大鼠适应性喂养1周，1周后进行实验分组，随机分为6组，分别为正常组（Control）、模型组（CCl4）、联苯双酯组（LBSZ，100 mg/kg）、竹节参总皂苷低、中、高（50、100、200 mg/kg）剂量组，每组8只。造模方式参考文献［18］：采取急性肝损伤间隔诱导法建立肝损伤大鼠模型，除正常组腹腔注射12%的橄榄油混悬液外，其余各组大鼠在第1、4、7天时腹腔注射12%的CCl4橄榄油混悬液，注射体积均为5 mL/kg。此期间除正常组、模型组大鼠给予双蒸水灌胃外，其余各组大鼠给予相应的药物剂量灌胃，各组灌胃体积均为5 mL/kg。第7天各组大鼠给予相应的腹腔注射处理及灌胃后，晚上禁食不禁水，次日（＞12 h）麻醉后收集大鼠血清与肝脏组织。

1.7 样本的采集及处理

称取体质量并记录，用20%的乌来糖（0.6 mL/100 g）行大鼠腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后即行取材。（1）取血清：收集血液，离心（4 ℃，4000 r/min，15 min），分离血清，-80 ℃保存；（2）取肝组织：取肝脏，放在4 ℃生理盐水中洗净，除去表面结缔组织，用滤纸吸干后称取质量。

1.8 观察及检测指标

1.8.1 血清AST、ALT、TBil、ALP水平测定 使用全自动生化仪检测各组大鼠血清中ALT、AST、TBil、IBil 水平。

1.8.2 肝组织病理学观察 大鼠肝组织经多聚甲醛固定24 h后，脱水、包埋，制作石蜡切片（5 μm），HE 染色，镜下观察细胞形态结构无异常，周围肝细胞索排列情况，是否可见融合性坏死，空泡样病变。

1.8.3 肝脏组织SOD、GSH-Px、MDA 水平测定 大鼠肝组织与生理盐水以1∶9的比例制成10%的肝组织匀浆，4 ℃条件下以转速10 000 r/min 离心5 min并保留上清液，依据各试剂盒说明书分别测定各组MDA 及SOD、GSH-Px的水平。

1.8.4 免疫组化检测大鼠肝脏p-NF-kB蛋白的表达 通过烤片1 h，温度为60 ℃，经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水后，进行抗原修复，加5%H2O2进行内源性过氧化物酶淬灭处理10 min，滴加5%BSA湿盒中封闭30 min；一抗孵育：滴加一抗（p-NF-kB工作浓度为1∶200）4 ℃孵育过夜；二抗孵育：加二抗，湿盒在37 ℃烘箱中避光孵育1 h。二氨联苯胺（DAB）染色镜下观察，苏木素复染，0.5%盐酸乙醇分化3 s，饱和碳酸锂返蓝40 s，然后脱水，透明，中性树脂封片，然后显微镜下观察拍照。用Image J软件分析各组的相对阳性表达面积。

1.8.5 蛋白免疫印迹实验检测PI3K-Akt、SIRT6-NF-KB相关通路蛋白 预先购买的PMSF需放置在-20 ℃冰箱，Riapa强裂解液4 ℃冰箱保存，将所需试剂和待匀浆组织拿出放入冰盒中，4×buffer需要先放在水浴锅中让结晶熔化后经过匀浆、变性、超声等进行BCA蛋白样品测定，然后配置分离胶和浓缩胶后，每个加样孔加5 μL样品，最后一孔加入2 μL预染的Marker 以分辨蛋白分子量大小，加样完成，进行电泳、转模。转膜完成，用5%脱脂牛奶进行封闭1 h，与一抗结合，4 ℃静置过夜。一抗孵育完成，从4 ℃冰箱中取出，滴加二抗，摇床孵育1 h，TBST 洗完膜后进行显影即可，最后用ImageJ软件分析带灰度值。

1.9 统计学分析

使用统计软件SPSS 22.0分析结果，数据以均数±标准差表示，单因素方差分析用于组间比较，Ρ＜0.05表示差异有统计学意义，利用Graphpad prism9.0做图，具体实验方法参考文献［19］。

2 结果

2.1 竹节参治疗肝损伤的网络药理学分析

竹节参含有15种有效化合物，包括皂苷、总皂苷、黄酮类等，对应靶点数259个，靶点排名较前的化合物为竹节皂苷Ⅳa、人参皂苷等。PPI统计发现排名较前的蛋白为Akt1、VEGFA、CASP3等（图1）。

图1 竹节参治疗肝损伤的GO、KEGG富集分析Fig.1 GO and KEGG enrichment analysis of treatment of liver injury with Panax japonicus.

2.2 TSPJ对ALI大鼠血清AST、ALT、ALP、TBil的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBil显著增高（Ρ＜0.01）；与模型组比较，各治疗组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBil显著降低（Ρ＜0.01，图2）。

图2 TSPJ对ALT、AST、ALP、TBil水平的影响Fig.2 Effect of total saponins of Panax japonicus on serum ALT,AST,ALP and TBil levels in rats with CCl4-induced liver injury.##P＜0.01 vs Control,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.3 TSPJ对ALI大鼠肝脏组织病理学变化的影响

正常组大鼠肝组织细胞形态结构无异常，也没有出现炎性细胞浸润的情况，周围肝细胞索以中央静脉为中心，呈放射状排列（图3A）。模型组大鼠肝脏细胞可见融合性坏死，空泡样病变，肝门区形态结构紊乱，肝细胞索消失（图3B）。与模型组相比，各给药组有不同程度的好转，大鼠肝脏组织坏死有不同程度的减轻，空泡样病变减少，肝索形态结构相对改善（图3C～F）。

图3 各组大鼠肝脏病理学变化Fig.3 Pathological changes of the liver in each group(HE staining,original magnification: ×200).A:Control;B:CCl4;C:LBSZ;D:TSPJ/50 mg·kg-1;E:TSPJ/100 mg·kg-1;F:TSPJ/200 mg·kg-1.The arrows indicate fusion necrosis(→),vacuolike lesions(↓),and confluent areas(←).

2.4 TSPJ对ALI大鼠肝脏组织的MDA、SOD、GSH-Px水平的影响

与正常组相比，模型组SOD、GSH-Px水平显著降低（Ρ＜0.01）；与模型组比较，各给药组SOD和GSH-Px活性水平均有不同程度的升高（Ρ＜0.01，图4A、B）。与正常组相比，模型组大鼠肝脏MDA水平显著升高（Ρ＜0.01，图4C），与模型组比较，各给药组肝脏MDA水平有不同程度的降低（Ρ＜0.01，图4C）。

图4 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝组织SOD(A)、GSH-PX(B)和MDA(C)水平的影响Fig.4 Effect of total saponins of Panax japonicus on SOD(A)、GSH-PX(B)and MDA(C)levels in liver tissue of rats with CCl4-induced liver injury.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.5 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝脏组织p-NF-κB蛋白表达的影响

正常组大鼠肝组织细胞内未见p-NF-κB表达阳性（图5 A）；与正常组比较，模型组中p-NF-κB阳性表达则明显增加，阳性细胞数增多（Ρ＜0.01，图5B）；与模型组比较，经给药治疗干预后，各给药组肝组织内p-NF-κB的相对阳性细胞数减少（Ρ＜0.01，图5C～G）。

图5 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝组织p-NF-κB表达的影响Fig.5 Effect of total saponins of Panax japonicus on expression of p-NF-κB in the liver tissue of rats with CCl4-induced liver injury.A:Control;B:CCl4;C:LBSZ;D:TSPJ/50 mg·kg-1;E:TSPJ/100 mg·kg-1;F:TSPJ/200 mg·kg-1.G:Bar-chart.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.6 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝脏PI3K/Akt蛋白表达的影响

相对于空白组，模型组PI3K、p-PAkt蛋白的表达水平显著下降，p-NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白的表达水平显著升高（Ρ＜0.05）；与模型组相比，药物干预组PI3K、p-Akt蛋白的表达水平显著升高，p-NF-κB p65、TNF-α与IL-6的蛋白的表达水平显著降低（Ρ＜0.05，图6）。

图6 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝组织PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达的影响Fig.6 Effect of total saponins of Panax japonicus on expressions of PI3K,p-Akt and Akt in rat liver tissues with CCl4-induced liver injury(Mean±SD,n=3).##P＜0.01 vs Control,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.7 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝脏p-NF-κB/NF-κB蛋白表达的影响

相对于空白组，模型组p-NF-κB p65蛋白的表达水平显著升高（Ρ＜0.05）；与模型组比较，药物干预组p-NFκB p65蛋白的表达水平显著降低（Ρ＜0.05，图7）。

图7 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝组织p-NF-κB、NF-κB表达的影响Fig.7 Effect of total saponins of Panax japonicus on expressions of p-NF-κB and NF-κB in liver tissue of rats with CCl4-induced liver injury.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.8 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝脏TNF-α、IL-6蛋白表达的影响

相对于空白组，模型组TNF-α、IL-6蛋白表达水平显著升高（Ρ＜0.05）；与模型组比较，TSPJ组TNF-α、IL-6蛋白表达水平有不同程度降低（Ρ＜0.05，图8）。

图8 TSPJ对CCl4致ALI大鼠肝组织TNF-α、IL-6表达的影响Fig.8 Effect of total saponins of Panax japonicus on expressions of TNF-α and IL-6 in the liver tissue of rats with CCl4-induced ALI.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

3 讨论

中医认为，肝损伤的主要病因病机为“瘀”“毒”“虚”，在治疗方式上可用活血化瘀、祛邪扶正的方法进行干预。竹节参作为土家族的著名民族药物，被土家族先民誉为“草药之王”［20,21］，其活血化瘀、补虚强壮的功效也较为符合肝损伤的病机和祛邪扶正的用药原则。本课题组前期实验研究表明［22］，竹节参具有多种生物活性，其中竹节参多糖可激活Nrf2-ARE信号通路，增强机体的抗氧化酶系表达，减轻CCl4引起的氧化损伤。研究表明［23,24］，竹节参含有皂苷类、糖类、氨基酸、挥发 油、无机元素等成分，其中皂苷类和糖类是其主要的化学成分。熊海容等［25］研究竹节参皂苷Ⅳa对于脂肪性肝炎的干预作用，结果表明竹节参皂苷Ⅳa 可以通过CD36-NLRP3信号通路降低脂质沉积与改善肝脏炎症,为脂肪性肝病的治疗提供新的思路。竹节参总皂苷可通过TLR4/NF-κB信号通路改善自然衰老大鼠脂肪组织炎症。竹节参总皂苷有减少炎症相关因子的药理活性，提高过氧化物酶系统活力的作用［26］，可能是发挥肝保护作用的基础，所以竹节参总皂苷对肝损伤可能有较好的治疗作用。

为了阐释竹节参总皂苷对CCl4致急性肝损伤的保护作用及其分子机理。课题组首先通过生物信息学筛选出竹节参中含有多种皂苷类活性化合物，结果表明，对ALI具有较好的保护作用，核心靶蛋白为AKT1，排名第一的信号通路为PI3K/Akt，提示竹节参总皂苷可能是通过调节PI3K-Akt信号通路发挥缓解ALI的作用。PI3K是磷脂酶激酶家族的成员，其成员具有脂肪酶和蛋白激酶活性［27］。PI3K-Akt信号通路的作用机制为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）特异性催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化［28］并通过与蛋白激酶B（Akt）N末端的PH结构域结合来激活3-磷酸肌醇依赖性激酶1（PDK1）。PDK-1和PDK-2分别磷酸化Akt中的Thr308和Ser473，Akt被磷酸化并被激活，进一步调节靶基因［29］。PI3K/Akt信号转导已成为细胞中重要的信号转导途径，对细胞增殖、存活、凋亡、代谢、和免疫反应具有显着影响［30］。研究表明［31］，AMPK/PI3K/AKT介导的氧化应激促进肝脏驻留巨噬细胞促炎反应，从而加剧了APAP诱导的急性肝损伤。WU等［32］发现，急性肝损伤中的AKAP12缺失激活了PI3K/AKT磷酸化信号通路，诱导PCSK6及其下游炎症相关基因的表达增加，并促使巨噬细胞产生大量的炎症因子，因此，PI3K/Akt通路与急性肝损伤密切相关［33,34］。

此外，通过文本挖掘发现抗炎抗氧化在ALI等疾病的治疗中倍受重视，其中核转录因子-κB（NF-κB）被认为是关键的炎症因子。当炎症在肝脏发生时，NF-κB乙酰化，从而下游炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6开始转录，导致炎症因子加速释放和炎症介质加快合成。

为了确定竹节参总皂苷是否对CCl4导致大鼠肝损伤有治疗作用，通过HE染色和免疫组化提示TSPJ降低p-NF-κB的含量发挥抗炎的作用。然后提取肝组织的总蛋白后对目的蛋白进行检测并比较各组之间目的蛋白总含量的相对变化，实验结果提示，相对于空白组，模型组PI3K、p-PAkt水平减少，p-NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白的表达水平提高，表明模型组的肝损伤较严重。而竹节参总皂苷中、高剂量组中的PI3K、p-Akt蛋白的表达水平明显升高，p-NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白的表达水平降低，提示竹节参总皂苷治疗组在治疗过程中可能增加机体PI3K、p-Akt的合成及储备能力，使之基础水平得到提升，在面对炎症因子攻击时更有能力去充分地应对，抑制炎症因子p-NF-κB、TNF-α、IL-6的表达，从而减轻CCl4持续性诱导的肝脏损伤。另外，HE染色和免疫组化提示TSPJ降低p-NF-κB的含量发挥抗炎的作用。

综上所述，竹节参总皂苷通过作用于PI3K/Akt/NF-κB信号通路发挥对CCl4所致肝损伤的抗炎及抗氧化作用，进而减轻了肝脏炎症与氧化损伤。该研究不仅揭示了竹节参总皂苷保护肝损伤作用机制，亦为靶向NF-κB的抗炎护肝研究提供了实验依据。