发酵党参黄酒的营养及功效成分分析

王 楠，高颖瑞，徐巧红，胡芳弟*

（1.兰州大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学 甘肃省党参产业技术工程研究中心，甘肃 兰州 730000）

党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf）是一种治疗脾胃虚寒、贫血和疲劳的中药[1]，富含丰富的糖类物质，是良好的发酵基质。多糖是党参中重要的活性成分之一，具有良好的抗氧化及免疫调节等作用。党参经过发酵后，其多糖的含量显著提高，体外抗氧化明显增强[1-2]。黄酒作为我国最古老的酒种，富含氨基酸、γ-氨基丁酸、多酚、多肽、糖类等成分。《本草纲目》中详载的药酒多数也以黄酒制成。黄酒可以促进中药中有效成分的溶出并降低毒副作用，达到减毒增效、矫臭去腥等作用[3]。本课题组前期研究已证实，党参黄酒（Codonopsis pilosula Huangjiu，CHJ）比普通黄酒具有更丰富的营养价值及更强的抗氧化活性，发酵党参中多糖、三萜、党参炔苷、氨基酸、黄酮等成分及抗氧化活性均高于普通党参[4-5]。目前国内外尚未有人对党参黄酒进行系统研究，通过对党参黄酒的成分及营养价值分析，全面阐述党参黄酒的营养价值，证明其保健养生功效。

本研究以发酵党参为原料，制备发酵党参黄酒（fermentedCodonopsis pilosula Huangjiu，FCHJ）。以党参黄酒（CHJ）为对照，测定FCHJ中的总酚、总黄酮、氨基酸及矿物元素含量及体外抗氧化活性，并采用小鼠脾淋巴细胞增殖实验、RAW264.7细胞的增殖和吞噬作用及NO的释放量探讨发酵党参黄酒多糖（fermentedCodonopsis pilosula Huangjiupolysaccharide，FCHJ-CP）体外免疫调节活性。旨在对发酵党参黄酒的生物活性研究及产业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料和菌株

新鲜白条党参（Codonopsis pilosula）：甘肃岷县；黍米、麦曲、酒药：甘肃省五山池黄酒厂；高活性安琪酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

蛋白胨、酵母膏：北京奥博星生物科技有限公司；琼脂、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）、台盼蓝及红细胞裂解液：北京索莱宝生物科技有限公司；葡萄糖：中国药品生物制品检定所；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：美国Sigma-Aldrich公司；中性红染液：北京Solarbio科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、青链霉素溶液0.25%、胎牛血清：美国HyClone公司；NO测定试剂盒（A013-2-1）：南京建成生物工程研究所。实验所用试剂均为分析纯或生化试剂。

多元素混标液（Ca、Fe、Na、Zn）（质量浓度为10 g/mL），质量浓度为K、Mg单标液（质量浓度为10 g/mL）：美国Inorganic Ventures公司；冬氨酸（aspartic acid，Asp）、苏氨酸（threonine，Thr）、丝氨酸（serine，Ser）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、脯氨酸（proline，Pro）、甘氨酸（glycine，Gly）、丙氨酸（alanine，Ala）、胱氨酸（cystinol，Cys）、缬氨酸（valine，Val）、蛋氨酸（methionine，Met）、异亮氨酸（isoleucine，Ile）、亮氨酸（leucine，Leu）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、组氨酸（histidine，His）、赖氨酸（lysine，Lys）、精氨酸（arginine，Arg）等氨基酸标准品（纯度均＞98%）：美国Sigma-Aldrich公司；糖化酶（酶活10万U/g）：甘肃省五山池黄酒厂。

1.1.3 培养基

RPMI1640培养基：美国Gibco公司；DMEM高糖完全培养基：美国HyClone公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖1%。固体培养基在此基础上添加琼脂2%，121 ℃条件下高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

2030型四极杆电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）仪：日本SHIMADZU公司；MMULTIWAVE型微波消解仪：奥地利安东帕公司；LS-35LD灭菌锅：美国致徽仪器有限公司；JP39V-1300破壁机：浙江苏泊尔股份有限公司；XSP-36倒置显微镜：江西凤凰光学控股有限公司；IS-RDD3台式恒温振荡器：美国精骐公司；3110系列水套二氧化碳培养箱：美国Thermo Fisher Scientific公司；infiniteF50酶标仪：上海博源生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵党参黄酒的加工工艺流程及操作要点

发酵党参制备：选取优质新鲜两年生白条党参，洗干净后用破壁机多次打浆直至成匀浆即得党参样品。将用温水活化后的高活性干酿酒酵母菌接种于YEPD固体培养基中。30 ℃培养72 h后挑取单个菌落于YEPD液体培养基中，30 ℃、220 r/min振荡培养，使菌落数达到1×107CFU/mL。取上述党参样品适量，高压蒸汽灭菌后，加入10%体积的酵母菌菌液30 ℃培养48 h，即得发酵党参。

黍米饭的制备：选取颗粒饱满、无霉变虫蚀的黍米洗净按照料液比1∶0.75（g∶mL）浸泡8 h，蒸米30 min。

糖化：待黍米饭的温度降至60 ℃左右时，分别加入发酵党参、党参样品，按照0.2%添加量加入糖化酶搅拌均匀，60 ℃糖化12 h。

前发酵：将糖化结束后的黍米冷却至30 ℃左右，分别按照0.1%、1%和15%添加量加入酵母、酒药及麦曲，充分搅拌均匀，于30 ℃恒温条件下进行前发酵7 d，待发酵醪液中几乎无气泡产生时转入后发酵。

后发酵：前发酵结束后密封，于18 ℃恒温发酵25 d。压榨、过滤：将黄酒进行压滤，取滤液在6 000 r/min条件下离心10 min，取上清液。

灭菌、装瓶：90℃灭菌10min后装瓶即得党参黄酒（CHJ）和发酵党参黄酒（FCHJ）。

1.3.2 发酵党参黄酒多糖的制备

FCHJ-CP的制备[6]：取酒样适量，加入无水乙醇至体系中乙醇体积分数至80%，4 ℃静置24 h，收集沉淀后用木瓜蛋白酶及Sevage法去除蛋白质，将多糖溶液于截留分子质量为3 500 Da透析袋中透析48 h旋转蒸发浓缩（70 ℃），冷冻干燥（-60 ℃，24 h）后即得发酵党参黄酒多糖（FCHJ-CP）。

1.3.3 分析检测

氨基酸含量测定：参照国标GB5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》；总酚、总黄酮的测定：参考文献[7-8]中的方法；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧阴离子及羟基自由基清除活性：参考文献[9-12]中的方法；矿物元素含量测定：参照文献[5]的方法。

FCHJ-CP对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用：参照参考文献[13]分离脾淋巴细胞，以CHJ-CP作为最佳给药浓度筛选的样品，设置Control组（阴性对照）、多糖样品组、ConA组、LPS组，参照文献[14]进行实验，测OD470nm值并计算刺激指数（stimulate index，SI）。

FCHJ-CP对RAW264.7细胞的免疫调节作用：参照参考文献[15]进行小鼠巨噬细胞RAW264.7培养，设置阴性对照组（Control组）、阳性对照组（LPS组）以及样品组，通过MTT实验评价其增殖作用。细胞增殖率=样品组OD570nm值/阴性对照组OD570nm值；采用中性红实验[16]测定其吞噬活力。细胞吞噬率=样品组OD540nm值/阴性对照组OD540nm值；NO的抑制率：采用NO测定试剂盒[17]。

1.3.4 氨基酸营养及呈味分析

氨基酸营养评价方法通过计算必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）占氨基酸总量（total amino acid，TAA）的比例，与世界卫生组织（world healthorganization，WHO）/联合国粮农组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）修订的人体必需氨基酸含量模式谱比较，计算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系数（ratio coefficientof aminoacid，RCAA）、氨基酸比值系数评分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA）、化学评分（chemical score，CS）、必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）进行评价，其计算公式如下：

氨基酸呈味评价方法通过计算剂量比阈因子（doseover-threshold factors，DOT）和味道指数（taste index，TI）进行评价，其计算公式如下：

1.3.5 数据处理

使用SPSS25.0对数据进行显著性差异分析。每个实验均重复3次，数据以“平均值±标准差”表示。使用OrignPro 2023版及GraphPad Prism 8进行绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵党参黄酒的氨基酸分析

以党参黄酒（CHJ）为对照，测定发酵党参黄酒（FCHJ）的游离氨基酸含量，结果见表1。

表1 发酵党参黄酒中氨基酸含量测定结果Table 1 Determination results of amino acid contents in fermented Codonopsis pilosula Huangjiu mg/L

由表1可知，发酵党参黄酒（FCHJ）、党参黄酒（CHJ）分别共检出17种氨基酸，包含8种必需氨基酸。FCHJ的TAA为7 571.43 mg/L，CHJ的TAA为6 932.82 mg/L，说明发酵党参加入后可显著提高党参黄酒中氨基酸的含量（P＜0.05）；FCHJ和CHJ的EAA/TAA高于或接近WHO/FAO提出的理想蛋白模式（EAA/TAA=0.4），说明二者均具有良好的营养价值。

Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys 9种氨基酸被称为药用氨基酸，是指人体不能自身合成，但对维持氮平衡有重要作用的氨基酸[18]。由表1可知，FCHJ中药用氨基酸占总氨基酸比例显著高于CHJ（P＜0.05），其中Glu、Asp和Lys的含量最高，总占比占药用氨基酸的50%以上；且FCHJ中Glu的平均含量（1 333.80 mg/L）显著高于CHJ中Glu的平均含量（924.07 mg/L）（P＜0.05）。Glu可以作为中枢及大脑的补剂，同时对治疗肝病也有极大的作用[19]；Asp对增强肝功能，缓解疲劳，预防心脏病等有重要作用，Lys可促进人体发育，对免疫及中枢功能的增强，均有重要作用[20]。

发酵党参加入后可显著提升党参黄酒中氨基酸总量、药用氨基酸及必需氨基酸含量，尤其是Glu，且添加发酵党参后可显著提升党参黄酒中药用氨基酸的占比（P＜0.05）。FCHJ的EAA/TAA接近WHO/FAO的理想模式，说明发酵党参黄酒具有较好的营养价值，可作为日常保健及食补之用。

2.1.1 氨基酸的营养评价分析

必需氨基酸占总氨基酸的含量百分比与WHO/FAO模式越接近，表明其蛋白质质量越好[21]。两种黄酒必需氨基酸占总氨基酸的含量百分比见表2。RAA和CS的值越接近1，说明蛋白质的营养价值越高[22]，低于1的为限制性氨基酸，其中最小的为第一限制性氨基酸[23]。两种黄酒必需氨基酸的评分值见表3。两种黄酒必需氨基酸比值系数、比值系数评分及指数值见表4。

表2 必需氨基酸占总氨基酸的含量百分比Table 2 Percentage of essential amino acids in total amino acids%

表3 必需氨基酸的评分值Table 3 Score values of essential amino acids

表4 必需氨基酸比值系数、比值系数评分及指数值Table 4 Ratio coefficient, score of ratio coefficient and indexes values of essential amino acids

由表2可知，2个样品的必需氨基酸占总氨基酸的含量百分比均高于根据WHO/FAO模式而低于卵清蛋白模式，说明2种样品均具有很好的营养价值，其中，FCHJ的必需氨基酸占总氨基酸的含量百分比低于CHJ。从单个必需氨基酸分析，除Met+Cys外，其他氨基酸占总氨基酸的含量百分比均高于WHO/FAO提出的理想蛋白模式。与FCHJ相比，CHJ中Val、Ile、Leu和Met+Cys的必需氨基酸占总氨基酸的含量百分比较高。综上，2种样品均有较好的营养价值。

由表3可知，2种样品的第一限制性氨基酸均为Met+Cys，除Met+Cys外，在CHJ中，限制性氨基酸为Val，在FCHJ中Val、Ile、Leu均为其限制性氨基酸。综上，CHJ的氨基酸的营养价值略优于FCHJ。

由表4可知，除了Met+Cys外，其他氨基酸的RCAA值均接近于1，说明FCHJ中蛋白质与模式蛋白中EAA推荐之接近为人体吸收的概率较大，其中Thr、Lys以及Phe+Tyr的RCAA＞1，说明这几种氨基酸超过标准模式，相对过剩。现代营养学认为，食品中氨基酸含量过高会降低蛋白质的营养价值，SRCAA值越小，蛋白质的营养价值越低，当评价蛋白质与模式值接近一致时，SRCAA值越接近于100。由表4可知，CHJ的SRCAA最大，达到73.09，FCHJ的SRCAA为70.34，与CHJ无明显差异（P＞0.05）。说明发酵党参黄酒及党参黄酒的氨基酸组成比例合理，营养均衡，其蛋白质的利用率较高。

2.1.2 氨基酸的呈味分析

以党参黄酒（CHJ）为对照，对发酵党参黄酒（FCHJ）进行呈味分析，结果见表5。

表5 发酵党参黄酒氨基酸的呈味分析结果Table 5 Taste analysis results of amino acids in fermented Codonopsis pilosula Huangjiu

将氨基酸分为鲜味、甜味、苦味、盐味氨基酸，将鲜味及甜味氨基酸划为优味氨基酸，将苦味及盐味氨基酸划分为劣味氨基酸[22-23]。由表4可知，党参发酵后，Glu和Asp的含量会成倍增加，这也解释了党参加入后其优味氨基酸的增加。剂量比域因子（DOT）为各呈味物质的含量与其阈值的比值，当DOT＞1时，认为该物质对呈味有贡献，由此可以确定主要呈味的氨基酸。在FCHJ中呈味氨基酸主要是组氨酸，组氨酸是苦味氨基酸，组氨酸的引入使黄酒的口感更丰富，而CHJ中呈味氨基酸主要是脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，是鲜味以及甜味氨基酸。味道指数（TI）是优味氨基酸的味道强度之和与劣味氨基酸的味道强度之和，是一个总的风味的评价指标，如果味道指数＞1，说明口感和风味良好。结果表明，2种样品的TI值均＞1，说明两种样品的口味均较好且各具特色。

2.2 发酵党参黄酒中人体必需矿物元素含量分析

以党参黄酒（CHJ）为对照，对发酵党参黄酒的矿物元素进行含量测定，结果见表6。

表6 发酵党参黄酒矿物元素含量测定结果Table 6 Determination results of mineral elements contents in fermented Codonopsis pilosula Huangjiu μg/L

由表6可知，FCHJ与CHJ样品均富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn等人体必需矿物元素，两种黄酒各矿物元素含量并未有明显的差异。

2.3 发酵党参黄酒抗氧化活性分析

以党参黄酒（CHJ）为对照，对发酵党参黄酒的抗氧化活性进行测定，结果见图1。由图1A可知，发酵党参黄酒DPPH自由基清除率随其添加量增加而增大，最大DPPH自由基清除率为97%，与党参黄酒最大清除率接近。由图1B可知，发酵党参黄酒超氧阴离子自由基清除率随其添加量增加而增大，最大超氧阴离子自由基清除率为98%，远高于党参黄酒最大清除率。由图1C可知，发酵党参黄酒羟基自由基清除率随其添加量增加而增大，最大羟基自由基清除率为100%，与党参黄酒最大清除率接近。

图1 发酵党参黄酒抗氧化活性测定结果Fig.1 Determination results of antioxidant activities of fermented Codonopsis pilosula Huangjiu

经检测，发酵党参黄酒的总多酚含量（599.17±2.74）mg/L，显著高于党参黄酒[（452.09±3.24）mg/L]（P＜0.05），增加了32.53%。发酵党参黄酒总黄酮含量为（65.24±3.92）mg/L，较党参黄酒增加了60.79%。发酵党参黄酒中总多酚、总黄酮含量增加是其抗氧化活性提高的主要原因[24-25]。

2.4 发酵党参黄酒多糖对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用

淋巴细胞是机体主要的免疫细胞，包含T细胞和B细胞。LPS是多糖复合物，可以激活免疫细胞的增殖能力，从而提高免疫作用，ConA可促进有丝分裂，增加免疫细胞的增殖。发酵党参黄酒多糖对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用结果见图2。

图2 发酵党参黄酒多糖对脂多糖诱导（A）及刀豆蛋白A诱导（B）的小鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用Fig.2 Immunomodulatory effect of polysaccharides from fermented Codonopsis pilosula Huangjiu on mouse splenic lymphocytes induced by LPS (A) and ConA (B)

由图2A可知，不同质量浓度的FCHJ-CP对LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞均有增殖作用且呈现剂量依赖性，当多糖质量浓度为100 μg/mL时，其增殖效果最明显（P＜0.05），且当FCHJ-CP质量浓度为25～200 μg/mL时，其增殖效果与阴性对照组相比，有显著性差异（P＜0.05）；由图2B可知，不同浓度FCHJ-CP对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞也具有增殖作用，除50 μg/mL外，FCHJ-CP质量浓度为25～800 μg/mL时，其增殖效果有显著性差异（P＜0.05），且当FCHJ-CP质量浓度为100 μg/mL时，其增殖效果最显著（P＜0.05）。结果表明，FCHJ-CP可使LPS或ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖，且当FCHJ-CP质量浓度为100 μgmL时，其增值效果最显著（P＜0.05）。

2.5 发酵党参黄酒多糖对RAW264.7细胞的增殖、吞噬及NO生成量的作用

巨噬细胞是评价免疫调节能力的重要载体，是多糖的关键靶标，负责呈递抗原[26-27]。不同质量浓度的FCHJ-CP对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖、吞噬及NO生成量的作用见图3。

图3 发酵党参黄酒多糖对RAW264.7细胞的增殖（a）、吞噬（b）及NO生成量（c）作用Fig.3 Effect of polysaccharides from fermented Codonopsis pilosula Huangjiu on proliferation (a), phagocytosis (b) and NO production (c) of RAW264.7 cells

由图3a可知，实验组的细胞增殖率均高于阴性对照组，且FCHJ-CP对巨噬细胞RAW264.7的增殖效果更明显，且当其质量浓度为200～400 μg/mL时，与阴性对照组比较，其增殖效果极显著（P＜0.01）。

吞噬能力是巨噬细胞的基本防御能力，对保护人体免受病菌损害有重要作用[28]。由图3b可知，FCHJ-CP与阴性对照组比较，质量浓度为100～800 μg/mL时，其吞噬效果极显著（P＜0.01），说明发酵党参黄酒多糖在一定的浓度范围内对RAW264.7细胞的吞噬能力有上调作用，能够提高巨噬细胞的非特异性免疫功能。

NO是一种具有氧化特性的自由基[29]，是活化巨噬细胞，杀灭病原微生物的主要效应分子，诱导型NO的合成在维持心血管系统平衡、防止动脉粥样硬化的方面起重要的作用，同时也是免疫细胞被激活的重要指标之一。由图3c可知，实验组细胞的NO生成量均极显著高于阴性对照组（P＜0.01），发酵党参组黄酒多糖可以促进NO的分泌。

3 结论

本研究以发酵党参为原料制备发酵党参黄酒（FCHJ），测定FCHJ中的总酚、总黄酮及氨基酸含量、矿物元素及体外抗氧化活性，并对发酵党参黄酒多糖（FCHJ-CP）体外免疫调节活性进行评价。结果表明，FCHJ共检出17种氨基酸，其中必需氨基酸8种，必需氨基酸占总氨基酸含量35.53%；两种黄酒营养丰富、呈味良好，均富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn等人体必需矿物元素。FCHJ对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、超氧阴离子、羟基自由基最大清除率分别为97%、98%、100%。FCHJ-CP质量浓度为200 μg/mL时，可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖（P＜0.05）、极显著促进RAW264.7细胞增殖和吞噬以及促进NO的释放（P＜0.01）。发酵党参黄酒不仅营养丰富、口味良好，具有良好的抗氧化及免疫调节活性，具有较好的开发应用前景。