微乳液中酶催化反应及W/O乳液结构稳定性研究

张义豪,刘笑彤,徐国峰,王文君,王晓敏,李群,许瑞,杜中玉*

(1.济宁医学院 基础医学院,山东 济宁 272067;2.兖州区实验高级中学,山东 济宁 272100)

微乳液,在1943年首次由Hoar和Schulman发现,是一种由表面活性剂、助表面活性剂、油与水等组分在合适比例下组成的无色、低黏度的,溶液中粒径在10～100 nm的体系,表现为透明和半透明状,是热力学稳定体系。1959年由英国化学家Schulman首次将上述体系称为微乳状液或微乳液。

自微乳液发现后,围绕着它提出了多个理论,在Schulman和Prince等的混合膜理论、Schulman和Bowcott等的双层膜理论、Robbins、Mitchell和Ninham等人的几何排列理论和R比理论。在这几个的理论中,Winsor等发展的R比理论更加完善,更被认可。通过R比理论可以将微乳液分为四种类型。R比理论以分子间相互作用力为基础,认为微乳液各组分之间必然存在着相互作用力,各个相互作用力之间叠加的最后决定了膜的性质,由此可用Aco表示油与表面活性剂之间的内聚能,表面活性剂之间的内聚能用Acw来表示,用AⅡ表示表面活性剂亲油基之间的内聚能,将Ahh定义为表面活性剂亲水基之间的内聚能,而Aoo则为油分子之间的内聚能,Aww为水分子之间的内聚能。由此定义,R=(Aco-Aoo-AⅡ)/(Acw-Aww-Ahh),并由公式可得,当R<1时,会形成水包油型微乳液,即为WinsorⅠ型,当R≈1时,会形成双连续型微乳液,微乳液为WinsorⅢ型,当R>1时,形成的油包水型微乳液类型为WinsorⅡ型,而当表面活性剂合适时,会形成单相体系的特殊形式的WinsorⅢ型微乳液,并将之命名Wirier Ⅳ型微乳液[1]。

微乳液的理论和应用发展极为迅速,已经被广泛应用于洗涤去污、催化、化学反应介质和药物传递等领域中。而酶参与的催化反应一直是生物学与化学交叉研究的重要领域,在酶催化的反应体系中如何保持和提高酶的活性是关键,而酶的活性又被反应介质和反应时的微环境影响,因此寻找能够更好地保持和提高酶活性的微环境和介质一直是科研工作中的重点[2]。而WinsorⅡ型微乳液,即油包水型微乳液(W/O)其大的界面积、底物溶解性的增强和能在分子水平上分散酶等特点都有利于酶催化反应的进行,而且由于界面膜的存在使得酶的活性得到了保障。

1 微乳液中的酶催化酯化反应

酶是具有高效和特异催化作用的蛋白质。催化剂只会加速化学反应达到平衡点,但不会改变平衡点。酶也是如此,但与非酶催化剂相比,酶具有极高的催化效率;此外,酶仅催化特定物质的某些化学反应,产生一定产物而不产生副产物,即酶具有极高的特异性。酶的催化能力称为酶活性,酶量的多少可以测量酶的活性。同时,酶的活性受各种环境条件影响。

酯化方法是羧酸和醇在少量无机酸存在下加热而转化成酯的有机合成方法。常用的无机酸有浓硫酸和干燥的氯化氢等。酯化反应一般反应过程长,反应副产物多,且反应为可逆反应,故需要酶催化以加快反应进程,控制反应产物,促进反应向目标产物方向进行。酯化反应的速率受多种因素的影响,在微乳液酶催化酯化反应当中,除环境因素外,表面活性剂的选择也是重要影响因素。

1.1 不同表面活性剂对微乳液中酯化反应的影响

酯化反应是微乳液中重要的化学反应之一,而不同表面活性剂对微乳液中酯化反应的影响不尽相同。微乳液中酶催化所用活性剂分为阳离子型、阴离子型、两性型和非离子型表面活性剂。其中大多数酶促反应在双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)表面活性剂应稳定的微乳液中进行,李干佐等人[3]就曾研究了CTAB/异辛烷/正戊醇/缓冲溶液中糖化酶催化淀粉的水解反应。研究显示其最大反应速率和米氏常数比起在水溶液分别提高了近6倍和3倍。Han等人[4]则用DBSA作为表面活性剂,建立DBSA/环己烷微乳液体系,并用圆柱假丝酵母脂肪酶(Ccl)催化乙醇与乙酸作为酯化反应模型,与AOT/环己烷微乳液体系进行比较。研究表明在DBSA体系中酯化反应速率及转化率大于AOT体系。其原因在于DBSA具有双重功能,即表面活性剂和酸催化剂,二者的协同作用使DBSA体系有更高的反应速率。近年来,反胶束的形成也成了人们研究的热点。Zheng等人[5]研究合成了一种Bronsted酸性-表面活性剂复合离子液体,3-(N,N-二甲基十二烷基铵)丙磺酸硫酸氢([SB3-12][HSO4]),它具有疏水尾部、亲水阳离子和Bronsted酸性反离子[SB3-12][HSO4],在油酸和乙醇的混合物中形成反胶束,促进酯化反应。其形成的反胶束具有亲水性,因此反应过程中产生的产物酯可有效的排除在反胶束以外,反应生成的水可以自动进入到反胶束,并且[SB3-12][HSO4]的自聚集会使酸性催化剂在反胶束界面集中。反胶束可以增强酯化反应和微分离器自动分离反应过程中产生的水和油酸乙酯,有利于酯的形成。油酸乙酯中水的分离既阻止了油酸乙酯的水解,又迅速促进平衡向产物油酸乙酯转移。此外,相较于前文提到的DBSA体系,该催化剂的高催化活性以及易于重复利用性,使其更加高效环保的应用于油酸乙酯的合成。表面活性剂对微乳液中酯化反应速率的提高还受温度、pH值、反应时间、反应物用量等影响。因此,在适宜的温度、pH值等条件下选择合适的缓冲体系和活化剂,对微乳液中的酯化反应具有重要意义。

1.2 内部“水池”环境对于酶活性的影响

1.2.1 水池大小对酶活性的影响

油包水微乳液具有一定大小的“水池”,含水量大小常以水与表面活性剂物质的量比ω0表示,即ω0=[H2O]/[SAA]。多项研究表明,每种酶在固定的反应体系中都有一个最适的“水池”大小值,当ω0很小或者较大时均会导致酶的活性降低。周国伟等人[6]在烷基聚葡糖苷微乳液中脂肪酶催化的酯合成反应动力学研究中表明,当烷基聚葡糖苷浓度增大时反应初始速率v0反而有所减小,这可能是因为随烷基聚葡糖苷浓度增大,体系中微乳液“水池”的总体积增大,酶的浓度减小、流动性增大,引起酶的增溶位置及活化构象发生某种变化,从而导致反应初始速率v0减小。此外,底物浓度下降也是酶活力降低的因素之一。当ω0较小时,酶的活力相对较低,可能是由于不能满足酶分子周围需要的一层必须水,而影响了酶活化构象的形成。

1.2.2 pH值对酶活性的影响

酶催化反应的重要特性之一是对微乳液微环境的pH值极其敏感,酶表面的电荷密度随pH值的变化而变化,从而导致酶与表面活性剂头基的相互作用产生变化。最适pH值的选择与酶种类、反应类型有关。最适pH值的微小偏离可使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活性;较大偏离时,维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰,导致酶蛋白的变性。

Kriegera等人[7]在AOT/异辛烷反胶束中,分别加入不同的缓冲溶液,研究PCL催化三油酸甘油酯的水解反应。缓冲溶液分别为乙酸盐(pH值=4.0～5.5)、磷酸盐(pH值=6.0～8.0)和Tris-HCl(pH值=8.0～9.0)。研究表明,酶的活力与pH值的大小呈钟形曲线,在pH值=8时酶的活性最大。同时研究还发现,不同的缓冲液对于酶的活性也有影响。该反应在磷酸盐溶液中酶的活力相较于在Tris-HCl缓冲液中更强。

2 水包油包水的稳定性研究

水包油包水(W/O/W)的最内部由单一水相W1组成,随后被较大油滴包裹,形成油/水乳液,该乳液再次分散到另一个水相中,从而形成了一个比较复杂的多相系统。由于其独特的多组分结构,它们应用范围很广,且具有很大的应用潜力。其中水在油滴中保持对于这些应用来说至关重要,但是,这种系统非常不稳定,可能会发生内部水滴之间的聚结、外部油滴之间的聚结,内部水滴和外部水相之间的聚结及扩散等,应用起来具有挑战性,比一般简单的单相乳液困难得多。因此研究其内部WO乳液的结构及其稳定性尤为关键。

2.1 内部WO乳液分散水相的平均液滴直径对微乳液平衡的影响

内相的液滴尺寸分布(W1)有着至关重要的作用,影响微乳化液的产品性能和平衡。不同粒径分布的稳定乳液主要取决于内部W1/O的处理参数,利用PFG-NMR测量内相(W1)的液滴尺寸分布和O相的表征,研究表明内部WO乳液分散水相的平均液滴直径小,可使油滴内部水相均匀分布,从而增加与外水相聚结的稳定性[8-9]。当直径足够小(<1 mm)时,才能更好的适应液中典型尺寸的油滴[10-11]。

2.2 渗透活性物质的加入对微乳液稳定性的影响

渗透活性物质(OAS)在乳液中发挥着至关重要的作用。Neumann等[12]以氯化钠、氯化钙和葡萄糖作为OAS,聚甘油-聚蓖麻油酸酯为亲脂性乳化剂制备了WO乳液,通过测量界面特性和乳液黏度来评估液滴的稳定效果。实验指出OAS不影响油相张力,也不影响乳液黏度,用于内部水滴,来限制乳液中水相之间的扩散过程,也可以通过影响内部乳液的结构,添加到内部水相的渗透活性物质,如某些电解质,会改变吸引力,从而减小水滴直径,来增加微乳液的稳定性,但必须使用足量的OAS来限制扩散引起的液滴成熟。据Ficheux[13]和Pays[14]等人研究表明OAS可以平衡拉普拉斯压力带来差异,以及可能会改善基于拉普拉斯压力的差异所带来的效应即内水相与外油相液滴聚合而导致平均液滴直径增加,乳液破裂,内部水相损失,出现典型的液结构的损失。

2.3 内部渗透压力对微乳液稳定性的影响

内部水相与外水相之间的渗透压力梯度可以导致水分子的扩散,当内部W1的溶质浓度高于外部W2的溶质浓度时,会使水分子进入内部水滴存在驱动力,使内部的水滴膨胀,反之,会使内部水相收缩[15]。通过向内部分散相中添加溶质,利用渗透压梯度来抵消拉普拉斯压力,来提高稳定性。但同时,也需要在外部水相加入少量溶质,双重作用使其产生更稳定的多相乳液,但微乳液被不含盐的缓冲液稀释后,W2溶质浓度远远小于W1,这将导致水分子从外水相运动到内水相,使内部发生膨胀[16]。

2.4 内部分散的液滴凝胶化对微乳液稳定性的影响

内相液滴凝胶化可以利用球状蛋白加热至其热变性温度来发生,加热后,W1中的球状蛋白展开,通过疏水键和二硫键相互聚集来提高系统的黏性和凝胶强度[17-18]。将内部水相(W1)含有20%乳清蛋白分离物(WPI)的缓冲溶液(pH值7,250 mmol/L氯化钠)制成W1/O/W2的微乳液,对其进行不同程度稀释和热处理,使W1的球状蛋白热凝胶化,使疏水性增加,进而导致系统黏度增加,稳定性提高。Iqbal等人[17-18]对内部分散相进行热变性,使其凝胶化,通过观察不同温度对微乳液W1/O/W2复合剪切模量的影响,指出流变变化是热不可逆的,并将其归因于WPI内球状蛋白的不可逆热性,球状蛋白经历了热凝胶化后,疏水性增加,使其在油滴之间形成联系,使系统黏度增加,同时影响多种乳液的稳定性。

2.5 乳化剂对微乳液稳定性的影响

许多研究小组研究了不同乳化剂的类型和浓度对液稳定性的影响,短链乳化剂有被证明从一个水相扩散到另一个水相,它们进入W/O/W液的内部水滴中会破坏液滴的稳定性,而生物聚合物如蛋白质和亲水胶体被假设有更好的稳定性能乳液,因为它不大可能扩散通过油膜并进入内部水滴,所以与短链乳化剂相比,大分子乳化剂甚至稳定剂更适合稳定液[14,19]。生物聚合物主要通过增加内外水相的黏度或凝胶程度等多种机制来提高乳液的稳定性[20-21]。它在微乳液中起到双重作用,既可以作为功能成分,减少有关此类配方中合成微乳剂的使用;也可以作为稳定成分,其不易从内外水相迁移和扩散,且可以在分散和连接的水相中形成网状结构,使黏性提高,表面活性生物聚合物还可以作为黑白乳化液滴外油水界面的有效稳定成分。

3 微乳液发展展望

不同微乳液体系已经被广泛研究,在微乳液中各种酶催化反应也成为重要研究对象,对于酶催化反应的研究大多数是在改变微乳液内部水相的内部环境或者不同的表面活性剂、溶剂和助表面活性剂来提高酶催化反应速率。而目前新型的水包油包水(W/O/W)在不同的工业领域作为封装系统或在食品工业中作为潜在脂肪替代品起到关键作用。微乳液的研究趋近成熟,如何更好地应用将成为关键。微乳液的内部环境可以用来模拟细胞内环境,希望在应用于工业封装、食品生产等领域的同时,未来研究应集中于研究更加稳定的制备方法和增强其长期稳定性的技术,使其内部可以发生更加复杂反应,为生物化学反应、药物合成反应提供更加广泛的应用前景,为医学发展、人类健康作出贡献。