复合菌剂的构建及其在沼液废水处理中的应用＊

李国光 郜晋楠 任静 杨丽华 韩文彪

（1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国科学院生态环境研究中心，鄂尔多斯固体废弃物资源化工程技术研究所，内蒙古鄂尔多斯 017000）

0 引言

利用沼气工程处理城市日益增长的有机废弃物是一种行之有效的途径［1］，但是沼气工程也会产生大量的沼液副产物。据统计，我国沼气工程每年产生的沼液数量达8 ～10 亿t［2］。城市有机废弃物厌氧发酵后的沼液因其浊度、色度、盐度较大，有机物、重金属、氮和磷等污染物含量较高，通常被视为高浓度污水［3］，必须经过合适的处理才能用作农肥或者达标排放。

生物处理方法是一种有效降低沼液中污染物质的方法之一。通过人工选育和基因重组等生物技术手段，得到一种或多种以目标污染物为营养源的高效微生物菌种，经扩大培养后吸附在载体上，投加至沼液处理系统中，从而降低其中大量的有机物，同时还能降低内部重金属、氮和磷等污染物，使沼液成为液态肥合理利用［4］。在实际应用中，单一菌株对沼液中污染物的去除效果有限，而将多种目标微生物单独培养后，再按一定比例进行复配，制备成复合微生物菌剂，对沼液中目标污染物可取得最佳的处理效果［5］。

本实验研究了污水处理中常见的7 株功能微生物对城市有机废弃物厌氧发酵沼液废水处理效果，并将其中4 株处理效果较好的单一菌株构建为复合菌剂用于处理沼液，同时考察了高效降解菌在硅藻土、麸皮、玉米粉、秸秆粉等复合载体上的生物活性，为处理沼液废水高效复合菌剂的开发和应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 沼液来源

供试沼液取自鄂尔多斯市沙圪堵镇沼气示范工程项目现场，该厂沼液发酵原料为城市生活垃圾、畜禽粪便和餐厨垃圾。沼液经充分腐熟、静置沉降后，取上清液并进行过滤备用。所得沼液的理化性质见表1，因原始沼液污染物浓度太高，影响菌种活性和测定结果，故将原始沼液稀释5 倍后进行后续试验。

表1 原始沼液理化性质 单位：mg/L（pH 值除外）

1.2 供试菌种

本试验所用7 株具有降解水体中污染物能力的功能菌分别为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、裂解亚氯酸假单胞菌（Pseudomonas chloritidismutans）、产气克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）、华仙肠杆菌（Enterobacter huaxiensis）、帚石南棒杆菌（Corynebacterium callunae）和副球菌（Paracoccus denitrifications），这些菌种均从自然界中通过富集培养、分离纯化得到，并保藏于内蒙古农业大学微生物与发酵工程实验室。在前期预试验中已测得各菌种在LB 培养基中生长曲线，并以沼液COD为去除率为目标，确定了各菌种最适接种量，为后期菌剂复配比例提供依据。7 株菌种生物学特性见表2。

表2 菌种生物学特性

1.3 载体来源

本试验所使用的载体为玉米秸秆粉、玉米粉、麸皮及硅藻土，其中硅藻土为市售，其他3 种取自周边农户，经粉碎后过20 目筛备用。

1.4 试验方法

1.4.1 单一菌株处理沼液废水试验

利用LB 液体培养基将上述7 株菌培养至对数生长期，将各菌的培养液以最适接种量（见表2）分别接入100 mL已灭菌的沼液中，然后将摇瓶置于30 ℃、150 r/min 的摇床中振荡培养7 d。培养结束后，将各处理沼液以8 000 r/min 离心10 min，取上清液并检测其中氨氮、COD、总磷浓度，并计算其去除率。每个处理设置3 个平行，并以不接菌的灭菌沼液为空白对照。

1.4.2 复合菌的构建及处理沼液废水试验

将1.4.1 节试验效果较好的短小芽孢杆菌、裂解亚氯酸假单胞菌、帚石南棒杆菌和产气克雷伯氏菌4株菌进行平板对峙培养试验，确定彼此没有拮抗作用后，分别在LB 液体培养基上培养至对数生长期，然后按照其最适接种量比例进行复配，制得由4 种菌株组成的复合菌液，将复合菌液以2%的接种量接入100 mL灭菌沼液中，以相同体积的无菌水代替复合菌液接入沼液作为对照，然后将摇瓶置于30 ℃、150 r/min 的摇床中振荡培养7 d，离心处理后，取上清液检测其中氨氮、COD、总磷浓度，并计算其去除率。

1.4.3 复合菌吸附载体选择试验

采用玉米秸秆粉、玉米粉、麸皮及硅藻土作为复合菌剂吸附载体，将前3 种载体进行等比例随机复配，设置玉米秸秆粉+玉米粉、玉米秸秆粉+麸皮、玉米粉+麸皮、玉米秸秆粉+玉米粉+麸皮4 个处理，每个处理总重为1 kg。为防止复合载体结块，在每个处理中加入300 g的硅藻土作为分散吸附剂，同时加入20 g发酵引物红糖，均匀搅拌后，用无菌水将各处理组的湿度调节到50%左右后进行高温灭菌，然后分别接入200 mL 复合菌液，在30 ℃下恒温保湿培养7 d后，置于35℃恒温烘箱中，进行鼓风干燥处理，制得固体复合菌剂。分别取10 g 样品并加入100 mL无菌水，在150 r/min 下振荡2 h 后，用稀释平板计数法，测定各处理的活菌数。

1.5 主要分析项目和计算方法

采用重铬酸钾法测定COD［6］，纳氏试剂分光光度法测定氨氮（GB 7479—1987），钼酸铵分光光度法测定总磷（GB 11893—1989），血球计数法测定复合菌剂中有效活菌数。

氨氮、COD、总磷去除率Q的计算公式如下：

式中，Q为去除率，%；X为原始沼液的氨氮、COD 或总磷含量，mg/L；Y为处理后沼液氨氮、COD 或总磷含量，mg/L。

2 结果与分析

2.1 氨氮去除效果与分析

图1 为7 株菌在各自最适接种量下对城市有机废弃物厌氧发酵沼液废水中氨氮的处理效果。从图中可知，7 株菌种都具有降解沼液中氨氮的能力，除了副球菌外，其他各菌株去除率均在60%以上。其中对沼液氨氮去除率最高的是裂解亚氯酸假单胞菌，去除率可达85.1%，其次是产气克雷伯氏菌、短小芽孢杆菌和帚石南棒杆菌，三者对沼液氨氮的去除率相差不大，分别为78.7%、77.1%和72.0%。对沼液氨氮去除率最低的是副球菌，仅有54.0%。

图1 不同菌株对沼液氨氮去除率

假单胞菌属、芽孢杆菌属和副球菌属中的多株细菌已经被证实有较好的去除污水中氨氮的能力，如尹红梅等［7］在养猪场筛选到的地衣芽孢杆菌，对养猪废水氨氮的去除率可达80.0%以上；杨继伟等［8］在污泥中筛选的假单胞菌，对人工模拟污水中氨氮的去除率可达84.7%，这与本试验研究的沼液中氨氮去除率结果相近；刘胜格［9］从城市排污口淤泥中分离的副球菌对废水中的氨氮去除率达70.0%以上，而本试验中副球菌对沼液中氨氮的去除率仅有54.0%，这可能是沼液复杂的成分组成对副球菌的生长代谢造成了一定的影响。克雷伯氏菌属在废水脱氮的应用也有报道，赵迪［10］从硝基苯污水处理池中筛选分离得到一株具有高效降解硝态氮的克雷伯氏菌，而本试验所用产气克雷伯氏菌对氨氮也具有较高去除率，说明该菌既可降解硝态氮，又可降解氨态氮。

2.2 COD 去除效果与分析

城市有机废弃物厌氧发酵沼液废水中的COD值较大，处理较困难，本试验所用的7 株菌对其均有较好的去除效果，如图2 所示，7 株菌对沼液中COD的去除率相差不大，均在65.0%以上，其中去除率最高的是帚石南棒杆菌，去除率可达82.7%。短小芽孢杆菌、裂解亚氯酸假单胞菌、副球菌和华仙肠杆菌也有较高的去除率，均在70.0%以上。解淀粉芽孢杆菌对沼液中COD 的去除率相对较低，只有66.3%。

图2 不同菌株对沼液COD 去除率

芽孢杆菌属中的许多菌株具有降解废水中COD的能力，惠治兵等［11］从马铃薯淀粉废水中分离出一株解淀粉芽孢杆菌，对COD 的去除率达71.7%；伍华雯等［12］利用固体化菌种枯草芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌处理养殖废水，废水中的COD 去除率也非常明显。本试验使用的解淀粉芽孢杆菌同样具有去除沼液中COD 的效果，只是处理效果不及惠治兵等人分离的菌株，这也说明不同来源的同种菌株对不同处理对象可能存在着效果差异。

2.3 总磷去除效果与分析

总磷去除效果如图3 所示。从图中可看出，供试7 株菌对城市有机废弃物厌氧发酵沼液废水中总磷的去除效果不及氨氮和COD，各菌去除率均不高。除了产气克雷伯氏菌达到30.5%之外，其余各菌均在30.0%以下。这可能与微生物脱氮和除磷机制相关，生物除磷法主要是聚磷微生物在交替的厌氧和好氧条件下，吸收系统中的PO43-并形成含poly-P污泥，从而通过排放含poly-P 富磷污泥将磷从污水中去除；而生物脱氮主要包括硝化反硝化、厌氧氨氧化、异养硝化-好氧反硝化等作用将氮素进行转化利用。在微生物脱氮除磷系统中，可能积累了过量的NO2-，从而抑制了各菌缺氧吸磷的过程，这可能是氨氮去除效果优于总磷的原因之一。裂解亚氯酸假单胞菌和帚石南棒杆菌对沼液总磷的去除率仅次于产气克雷伯氏菌，为28.5%和24.5%，去除率最低的是副球菌，仅有15.4%。

图3 不同菌种对沼液总磷去除率

在污水系统中，除磷菌降解性能除了与自身特性有关外，也与所处环境有着密切关系。城市有机废弃物厌氧发酵后的沼液中，浊度、色度、盐度较大，悬浮物、重金属等污染物含量较高，这些物质成分较为复杂，可能影响了各菌种对总磷的去除效果［13］。有研究表明，将多种特定功能的单一菌种进行复配，构建为复合菌剂，能够极大地提升废水中污染物的去除率，这为沼液中总磷的高效去除提供了研究思路。

2.4 复合菌去除效果分析

从以上试验结果发现，短小芽孢杆菌、裂解亚氯酸假单胞菌、帚石南棒杆菌和产气克雷伯氏菌对沼液中污染物去除效果较好，故将这4 株菌按照最适接种量进行复配，并构建为复合菌，考察其对沼液废水的处理效果，结果见图4。图中表明，复合菌对沼液中3 种污染物的去除效果与单一菌相比均有提升，氨氮的去除率达87.5%，较单一菌最高值增加了2.4%，COD去除率达86.4%，较单一菌最高值增加了3.7%，二者提升幅度较小。但是总磷的去除率有较大提升，去除率达63.2%，较单一菌最高值增加了32.7%，充分发挥了菌群互作的优势。

图4 复合菌对沼液废水处理效果

之所以有这样的结果可能原因是4 株菌之间产生了某种协同作用，从而促进了某些功能基因的表达，但具体机制有待确定［5］。王亚军等［14］就将一株克雷伯氏菌与一株铜绿假单胞菌进行复配，发现二者能协同增强除磷，在最适比例下，生活污水中总磷降解率能达到99.4%。樊婷婷等［15］将恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、地衣芽孢杆菌和土生克雷伯氏菌组成的复合菌剂用于处理河道污水，对总氮、氨氮、总磷、COD 有最高的去除率，分别达到78.3%、82.8%、86.6%、83.9%，极大地发挥了复合菌的功能优势。

复合微生物菌剂在废水处理实际应用中也存在一些问题，如各菌种间的相互作用不都为协同作用，也可能存在拮抗作用；菌种在不同吸附载体上，因生长速率不同可能会造成混合菌群各菌种比例失调，从而影响菌剂应用效果。因此，需要进一步研究复合微生物菌剂在不同载体上的生长情况，优化其培养条件。

2.5 复合菌剂载体选择及活菌数分析

从实际应用角度考虑，复合菌剂中有效活菌数越多，高效降解菌种类越多，该菌剂处理效果会越好，而吸附载体是菌剂构建能否成功的关键。良好的吸附载体不仅能吸附污水中的污染物，其表面的微孔更有利于微生物的附着，同时也可以为微生物提供丰富的食物来源和适宜的生长环境，从而将载体的吸附和生物降解2 个过程充分耦合起来，具有极强的污水处理累加效应［16］。因此本试验选择了秸秆粉、玉米粉、麸皮等常用的生物质吸附载体对复合菌剂中微生物的生物活性进行了研究。不同载体构建的菌剂中有效活菌数见表3。可以看出，秸秆粉+玉米粉+硅藻土的载体组合有效活菌数最高，达到了2.91×108CFU/g，说明复合菌在该载体上吸附量更高，生长繁殖更好；最低的是秸秆粉+麸皮+硅藻土组合，仅有4.8×107CFU/g，可能是该载体组合的营养成分不足，不能满足复合菌株的正常生长，从而使菌剂中活菌数降低。

表3 不同载体菌剂中有效活菌数

单一载体对菌剂中生物活性的保护有限，而将多种友好型载体以一定比例进行复合，可提高复合菌剂稳定性和有效活菌数。而在载体的选择上，最常用的就是植物源载体与非金属矿物质载体进行复配组合。马晓亮［17］将玉米粉、蚕蛹粉、锯末、麦麸、硅藻土等5 种载体进行复合制作固化菌剂，发现5 种载体以不同的比例进行复合时，可使菌剂中有效活菌数最大。本试验中使用的植物源载体秸秆粉、玉米粉和非金属矿物质载体硅藻土组合同样具有最高生物活性。

图5 是试验制备的不同载体构建的复合菌剂，可以看出不同载体组合构建的复合菌剂粒径不同，颜色各异，总体为土黄色粉末状固体，具有发酵物特有的气味，使用时只需直接投加，且便于保藏和运输，大大提高了应用范围。

图5 不同载体组合构建的复合菌剂

3 结论

通过单菌对比及复合菌剂构建试验发现，生物处理法对城市有机废弃物厌氧发酵沼液降解效果明显，试验表明：

（1）7 株菌种都具备降解沼液中氨氮、COD和总磷的能力，其中氨氮去除率最高的是裂解亚氯酸假单胞菌和产气克雷伯氏菌，去除率分别达85.1%和78.7%；COD 去除率最高的是帚石南棒杆菌和短小芽孢杆菌，去除率可达82.7%和76.1%；总磷去除率相对最高的是产气克雷伯氏菌，去除率达到30.5%，而其余均在30%以下。

（2）将短小芽孢杆菌、裂解亚氯酸假单胞菌、帚石南棒杆菌和产气克雷伯氏菌按照最适接种量进行复配构建为复合菌后，对沼液中氨氮的去除率达87.5%，COD 去除率达86.4%，总磷的去除率达63.2%，3 种物质的去除率较单一菌最高值均有提升，但是总磷去除率效果最好，充分发挥了菌群互作的优势。

（3）秸秆粉+玉米粉+硅藻土更适合做吸附载体，复合菌在该载体上吸附量更大，生长繁殖更好，有效活菌数最高，达到了2.91×108CFU/g，为复合菌剂的应用提供理论基础。