AB血浆倍比稀释在高效价自身抗体患者抗体筛查中的应用研究

任丽 李晓莉 肖松 李小飞 刘志忠

1首都医科大学康复医学院，北京 100069；2北京丰台右安门医院输血科，北京 100071；3首都医科大学附属友谊医院输血科，北京 100032

日常血库工作者在选择供受者相合红细胞成分血液时，输血前相容性检测试验会遇到抗体筛查三系细胞均阳性，自身对照及直接抗人球试验也阳性；再用16系谱细胞抗体鉴定时全部阳性，且反应强度无差别[1]。此时患者如有严重贫血，需要输注红细胞成分时，我们要解决是否有同种抗体被自身抗体掩盖的问题。目前，比较常用的方法是用自身红细胞的吸收与放散试验反复操作，将受血者血浆中自身抗体吸收，直到直接抗人球试验阴性后，才可进行血浆的同种抗体筛查。但对于高效价的自身抗体，吸收放散试验结果不理想，难以达到消除自身抗体的目标[2]。一些实验室常采用盐水稀释抗体，但是盐水法常难消除高效价自身抗体的干扰。我们选取盐水效价高的6例自身抗体患者标本，改用AB血浆作为倍比稀释液测定效价，先验证能否改变自身抗体标本的反应体系，在多少倍稀释可消除自身抗体的影响；再确认与常规盐水法对比检测同种抗体效价是否相符；观察将选择自身抗体患者标本与含有已知同种抗体标本进行人为混合，再进行同种抗体效价的测定，是否与之前效价比对，以期评价是否达到模拟真实世界的标本的目标。最后用此方法检测4例真实世界标本，即含有已知同种抗体的自身抗体标本。报告如下。

材料与方法

1 标本来源

2020年1月1日—2023年10月10日我院住院患者外送检测的抗体筛查阳性标本，25例，其中盐水稀释效果差的6例自身抗体标本（反应强度≥3+）和4例含自身抗体且分别存在抗-C、抗-E、抗-Jka、抗-cE抗体的受血者标本，见表1。16例同种抗体的标本见表2。以上抗体种类均经本市血液中心参比实验室确定。

表1 标本来源组成

表2 16例同种抗体盐水稀释和AB浆倍比稀释测效价结果

1.1 O型健康献血者3名，自制1%试剂红细胞。AB血浆为3例以上正常献血者血浆混合，不规则抗体筛查均为阴性。用于盐水法和AB血浆法自身抗体效价测定。

1.2 另选取10名O型健康献血者，对应上述16例标本含有同种抗体相应纯合子抗原，配制抗体效价检测1%试剂红细胞。用于同种抗体效价测定。

1.3 人为混合的16例血浆标本，前4例自身抗体标本，每1个分别对应每3个同种抗体血浆，后2例自身抗体每1个分别对应每2个同种抗体血浆，按1∶1混合。不限ABO血型，共16管人为混合标本，参照1.2选取O型健康献血者红细胞作试剂红细胞进行检测。

1号自身抗体加1、2、3号同种抗体，

2号自身抗体加4、5、6号同种抗体，

3号自身抗体加7、8、9号同种抗体，

4号自身抗体加10、11、12号同种抗体，

5号自身抗体加13、14号同种抗体，

6号自身抗体加15、16号同种抗体。形成16个混合标本。

1.4 4例含自身抗体且分别存在抗-C、抗-E、抗-Jka、抗-cE抗体的受血者标本，用于AB血浆稀释法进行抗人球蛋白试验（微柱法）的不规则抗体筛查。

2 试剂与仪器

单克隆抗-A、抗-B（上海血液生物技术有限公司，批号20220203）；抗-C、抗-c、抗-D、抗-E，抗-e、抗-M、抗-lea、抗-Jka（上海血液生物技术有限公司，批号：20210401、20221103）；A型、B型试剂红细胞 （Diana，批号3061138）；抗体筛查三系细胞（Diana，批号：23035、23037、23041），均在有效期之内使用。WADIANA/8XT（Diana）、血型卡孵育器及离心机（Diana） 、血清学离心机（BASO2020-2）。

3 方法

所有试验均在抗人球蛋白试验（微柱法）体系下进行。

3.1 盐水稀释法

将自身抗体患者的血浆进行盐水倍比稀释，稀释2，4，8，16，64，128，256，512，1 024倍，1%预制的三人份O型红细胞反应于抗人球蛋白试验（微柱法）中，至自身抗体消失，以1+为最终结果，记录效价。从10名O型健康献血者找出相应抗原献血者进行16个已知同种抗体进行正常效价测定。

3.2 AB血浆稀释法

将自身抗体患者的血浆进行预制AB血浆倍比稀释，稀释2，4，8，16，32，64，128倍，1%预制的三人份O型红细胞反应于抗人球蛋白试验（微柱法）中，至自身抗体消失，以1+为最终结果，记录效价。同3.1，再按此倍比稀释的血浆与有相应抗原红细胞进行反应[3]，对16个已知同种抗体AB血浆倍比稀释进行效价测定。

3.3 16例同种抗体血浆与自身抗体血浆混合标本测定各自效价

第一管等体积混合（效价记为2），第二管开始分别以盐水、AB血浆倍比稀释，稀释4、8、16、32、64、128倍，观察在模拟自身抗体存在的情况下同种抗体效价检测结果的变化。

3.4 AB血浆做为稀释液进行抗体筛查试验

用AB血浆倍比稀释自身抗体合并同种抗体的4例患者标本进行抗体筛查、抗体鉴定。

结 果

1 两种方法测定6例自身抗体效价

1.1 用盐水倍比稀释法测6例自身抗体效价，记录如下：

用盐水法检测6例自身抗体效价，效价均大于1∶512，见图1。

图1 6例自身抗体盐水倍比稀释法测效价

1.2 用AB血浆倍比稀释测6例自身抗体效价，效价均为1∶4，见图2。

图2 6例自身抗体AB血浆倍比稀释法测效价

2 分别用盐水和AB血浆稀释16例同种抗体测效价。见表2。

除13号效价为2的抗-M，血浆反应相略高于盐水相外，AB浆倍比稀释法与常规盐水法16例同种抗体效价测定一致。

3 自身抗体和同种抗体同比例混合测效价，第一管为两标本混合，第二管开始分别用盐水、AB浆倍比稀释。结果见表3。

表3 人为配比自身+同种抗体的16例混合标本盐水和AB浆倍比稀释测效价结果

混合后盐水效价测定，效价≥16时，同种抗体效价与原效价相符，效价＜16时，盐水倍比稀释后效价均为1∶16；而AB血浆稀释法同种抗体≥1∶8时，可检出与原同种抗体效价全相符。小于1∶4无法分辨同种抗体和自身抗体。

4 自身抗体存在抗-C、抗-E、抗-Jka、抗-cE的四个受血者标本用AB血浆稀释，抗体筛查结果，见表4、表5、表6、表7。

表4 受血者1含抗-C抗体筛查反应格局表（I号细胞有C抗原、II、III号无）

表5 受血者2标本含抗-E抗体筛查反应格局表（Ⅱ号细胞有E抗原、Ⅰ、Ⅲ号无）

表6 受血者3标本含抗-Jka抗体筛查反应格局表（Ⅰ、Ⅲ号细胞有抗原、II号无）

表7 受血者4含抗-cE标本抗体筛查反应格局表（Ⅱ、Ⅲ号细胞有抗原、其他无）

讨 论

自身抗体产生原因较多，目前认为多为自身免疫性疾病或药物所致，但发生机制尚未明了。其中自身免疫性溶血性贫血是常见的最棘手的输血相容性检测难题。自身免疫性溶血性贫血（自免溶贫，autoimmune hemolytic anemia，AIHA）由于免疫调节功能紊乱，产生了针对自身红细胞抗原的抗体和（或）补体，从而引起红细胞加速破坏（即溶血）[4]。常见的是温抗体型自身免疫性疾病，血清中的自身抗体是IgG型的，与所有的红细胞在间接抗人球蛋白试验（IAT）中都呈阳性反应[5]。此类患者需要经常输血治疗，会增加了同种抗体的产生频率[6]导致配血风险加大。当自身抗体和同种抗体同时存在时，由于高效价自身抗体导致无差别凝集度，抗体鉴定及交叉配血十分困难。较重贫血的患者标本中红细胞数量偏少，在高效价自身抗体存在的情况下，难以将自身抗体吸收完全，不仅耗时过长，而且反复洗涤易造成红细胞破碎溶血，影响试验结果判读。放散后的红细胞存在于盐水溶液中，重复加入患者自身血浆，可能会因稀释漏检同种抗体。由于耗时过长，也不适用于急危重患者[7]。输血行业大多认同主侧交叉配血试验反应强度低于自身对照反应强度的方法选择供血者。同种抗体和自身抗体反应强度一致并不代表造成输入的供者红细胞溶血风险程度相同。鉴定同种抗体是否被强自身抗体掩盖无疑是非常需要的。

存在自身抗体的患者，多数免疫球蛋白水平增高，或者循环复合物增多，C3补体也会下降[8]，从而造成一定程度的溶血，往往CRP升高，血沉加快。酸中毒导致的血浆pH值、阴阳离子等位点变化，导致患者血浆组成成分的变化会引起体外配血反应体系改变。我们通过检测上述6例自身抗体及4例自身和同种抗体同时存在的患者血浆，发现白球比均异常，甚至白球比倒置。在血浆置换后的患者实验室检查中发现，免疫球蛋白降低，直接或间接抗人球蛋白试验会明显减弱，这也是一个很好的证明[9-10]。因此我们联想到能否利用健康者血浆ABO同型血浆或AB血浆进行稀释，随着正常血浆比例的增高，改善白球比例，消除自身抗体的抗人球蛋白试验的反应性。6名自身抗体患者和4名受血者1-4，用盐水稀释再配血的效果差。但是在人为添加的16例标本效价中≥16的标本，盐水效价测定，同种抗体效价与原效价相符，可能是由于同种抗体的添加也相当于健康血浆加入，在一定程度上改善了白球比，改变了血浆的反应体系。

图2显示AB型血浆稀释效价在1∶4。说明AB浆能很好地改变自身抗体患者血浆反应体系，消除自身抗体的影响。表2中16例同种抗体在盐水和AB血浆稀释时，仅在一例抗-M效价1∶2时，两者有区别，且血浆相略高，为1∶4。说明血浆相与盐水相在同种抗体检出时无差别，用AB浆测定效价不会影响效价测定。表3说明了人为添加组合成含同种抗体的自身抗体标本除了1∶4以下的同种抗体测定受自身抗体的影响，只要超过1∶8效价，与原效价完全一致，由于都是选择O型红细胞为指示细胞，两个非同型患者血浆混合不影响反应体系，可行模拟自身抗体+同种抗体的真实世界标本。表4、5、6、7是真实世界的标本，同时含有同种抗体和自身抗体，并已在本市血液中心确定抗体性质。在用AB血浆不同倍数稀释中，可通过与抗体筛查三系细胞，根据强弱变化检出同种抗体。只要同种抗体效价大于1∶4均可检出。一些研究表明效价低于1∶2时对患者输血安全无影响[11-12]。鉴于抗体筛查试验的半定量检测方法，患者体内产生的大多数同种抗体效价在1∶4以上时，溶血的风险才较大。自身抗体低效价时，亲和力不强，部分可用盐水稀释可解决自身抗体干扰同种抗体检出。一旦自身抗体效价过高，盐水稀释法就难以检出是否同时存在同种抗体。此时我们建议可用AB血浆作为稀释液。由于难以获取高效价自身抗体且有同种抗体的标本，本试验的真实世界样本只有4例。当同种抗体效价较低时，自身抗体的干扰难以消除，临床上仍有一定溶血的风险。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突