苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响

黄超 方兴刚 陈璐

脑胶质瘤是中枢神经系统颅内原发性恶性肿瘤,据世界卫生部门统计,2020年全球肿瘤患者增加达20多万人[1]。婴儿至老年人都有发病患者,年龄越大恶性程度越大,在颅内呈浸润性生长[2]。常规治疗手段为手术治疗再辅以放疗和化疗,生存期较短[3]。铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化物过度积累介导的细胞死亡形式,研究发现,铁死亡也可以杀死肿瘤细胞[4]。因此,探究铁死亡对治疗肿瘤具有重大意义。苍术素是茅苍术挥发油的主要成分,现代医学研究表明苍术素具有抗菌、抗肿瘤等作用[5]。邵晨等[6]研究表明苍术素可以抑制细胞因子分泌和阻断细胞周期,从而抑制人结直肠癌LS1747T细胞增殖。He等[7]研究表明苍术素可以抑制肝癌Huh7和HCCM细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡和细胞周期停滞。大量研究表明Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路与铁死亡密切相关。谌程程等[8]研究表明鸦胆子苦醇可以下调Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路从而促进铁死亡,诱导皮肤磷癌cSCC细胞凋亡,并抑制其增殖。芮玲等[9]研究表明银杏素可以通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路,进而抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其铁死亡。所以推测Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路在铁死亡过程中发挥重要作用。因此,本研究就苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响进行探究,为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与动物 U251细胞购自于深圳市豪地华拓生物科技有限公司。选取雄性SPF级裸鼠30只(20.0±2.0 g),购自厦门大学,合格证号：SCXK(闽)2018-0003,适应性饲养1周,取食和饮水不限制,喂养温度(22.0±2.0)℃,相对湿度(60±5)%,光照为12 h光-暗循环(AM 7∶00～PM 7∶00)。

1.2 试剂 苍术素购自上海赢瑞生物医药科技有限公司;Nrf2抑制剂-ML385购自北京百奥创新科技有限公司;胰蛋白酶购自无锡云萃生物科技有限公司;胎牛血清购自深圳振强生物技术有限公司;RPMI 1640培养基购自广州塞库生物技术有限公司;MTT、Edu试剂盒购自江西江蓝纯生物试剂有限公司;Fe2+、MDA、LDH、GSH、ROS试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4一抗及二抗均购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养与分组 (1)于RPMI 1640培养基、37℃、5% CO2的环境中培养U251细胞,待细胞长到对数期时,收集细胞传代,进行后续试验。(2)将细胞分为对照组、苍术素低剂量组(5 mol/L)、中剂量组(10 mol/L)、高剂量组(20 mol/L)[7]、ML385组(1 mol/L)[8],5组细胞进行相应处理后进行培养,培养48 h后进行后续实验。

1.4 Fe2+、MDA、LDH、GSH、ROS水平检测 收集5组培养细胞,按照试剂盒说明书步骤,检测相应指标。

1.5 MTT法、Edu染色检测细胞增殖 将5组U251细胞于96孔板中进行培养,在24 h、48 h时,分别向每孔中加入10 μL MTT溶液,孵育4 h,再加入150 μL DMSO,震荡溶解,酶标仪490 nm处检测吸光值。于24孔板中培养上述各分组U251细胞36 h,然后向每孔中加入Edu孵育2 h,按照试剂盒说明书进行Edu及DAPI染色,然后用荧光显微镜采集5组细胞图像,采用Image J软件分析定量各组Edu阳性细胞数及总细胞数,计算细胞增殖率,增殖率=Edu阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集5组培养的U251细胞,用PBS清洗,离心收集细胞,将细胞重悬于500 μL 1×结合缓冲液中,根据凋亡试剂盒说明书步骤,加入Annexin V-FITC溶液与PI试剂,室温避光反应15 min,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 Western blot检测蛋白表达 用蛋白裂解液裂解5组U251细胞,蛋白提取试剂盒提取5组细胞总蛋白质,并检测蛋白浓度,将蛋白变性后电泳进行分离蛋白并转膜,5%脱脂奶粉封闭液中封闭,然后加入Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4(稀释1∶1 500)一抗4℃摇床过夜,洗膜后再分别加入相应二抗(稀释1∶5 000)孵育,然后使用ECL发光液显影,用Image-Pro Plus进行定量分析(β-actin为内参蛋白)。

1.8 裸鼠成瘤实验 取正常培养的U251细胞,调整细胞浓度为(2×106个/mL)制备成细胞悬液,BALB/c裸鼠皮下注射细胞悬液,当肿瘤长到约120 mm3时[10],将荷瘤裸鼠分为模型组、苍术素组(40 mg/kg)[11]、ML385组(30 mg/kg)[12],每组10只,苍术素组给予苍术素灌胃40 mg·kg-1·d-1,ML385组腹腔注射ML385 30 mg·kg-1·d-1,模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液,持续15 d。

1.9 裸鼠肿瘤体积、质量测定 用药结束后,处死裸鼠,测定肿瘤体积,质量,计算抑瘤率,抑瘤率=(模型组肿瘤质量-给药处理组肿瘤质量)/模型组肿瘤质量×100%。

1.10 Western blot检测各肿瘤组织Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平 取肿瘤组织冰浴研磨匀浆,使用RIPA裂解液充分裂解,通过离心获取总蛋白,后续操作同1.7。

2 结果

2.1 5组细胞Fe2+、MDA、LDH、GSH、ROS水平检测 与对照组比较,苍术素低剂量组、中剂量组、高剂量组U251、ML385组细胞Fe2+、MDA、LDH、ROS水平显著升高,GSH水平显著性降低,呈浓度依赖性(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞Fe2+、MDA、LDH、GSH、ROS水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 5组细胞Fe2+、MDA、LDH、GSH、ROS水平比较 n=6,

2.2 5组U251细胞增殖能力比较 与对照组比较,苍术素低剂量组、中剂量组、高剂量组、ML385组U251细胞OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率都显著降低,呈浓度依赖性(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表2。

图1 5组U251细胞增殖;Edu阳性呈红色,DAPI呈蓝色(Edu染色×200)

表2 5组细胞增殖能力比较n=6,

2.3 5组U251细胞凋亡率比较 与对照组比较,苍术素低剂量组、中剂量组、高剂量组、ML385组U251细胞凋亡率显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且呈浓度依赖性;与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见图2,表3。

图2 5组细胞凋亡结果

表3 5组细胞凋亡率比较n=6,%,

2.4 5组U251细胞中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平比较 与对照组比较,苍术素低剂量组、中剂量组、高剂量组、ML385组U251细胞Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高,呈浓度依赖性(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图3,表4。

图3 5组U251细胞中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平比较;A 对照组;B 苍术素低剂量组;C 苍术素中剂量组;D 苍术素高剂量组;E ML385组

表4 5组U251细胞中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平比较 n=6,

2.5 苍术素对裸鼠肿瘤生长的影响 与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积均显著性降低,(P<0.05);与苍术素组比较,ML385组裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积和抑瘤率差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 苍术素对裸鼠肿瘤生长的影响 n=10,

2.6 3组裸鼠肿瘤组织Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平比较 与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高,(P<0.05);与苍术素组比较Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表6,图4。

图4 5组裸鼠肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平比较;A 模型组;B 苍术素组;C ML385组

表6 3组裸鼠肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平比较 n=10,

3 讨论

脑胶质瘤是目前临床一种常见的异质性原发肿瘤,数据显示,在各年龄段均有发生,在年龄方面无明显特异性,发病率为约8/100 000[13]。目前,其发病机制尚不明确,对其治疗效果也不尽人意,预后效果差,死亡率高。许多化疗药物也逐渐产生耐药性,治疗效果不佳[14]。铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化物积累导致的死亡,引发铁死亡有望成为一种有效的治疗癌症途径[15]。因此,开发新的药物诱发铁死亡用于脑胶质瘤的治疗具有重要意义。

天然药物通常具有高效和低毒的特性,苍术素是一种天然中药,以往的研究显示,其具有抗炎、抗肿瘤的特性[16]。Li等[17]研究表明苍术素可以诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡和自噬。Zhang等[18]研究表明苍术素可以抑制肺癌A549细胞增殖,同时促进其凋亡和细胞周期停滞。GSH可以降低过氧化物酶反应,进而抑制ROS和MDA积累和铁死亡的激活,铁死亡可以诱导细胞膜结构破坏使其释放LDH。本研究中,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞的Fe2+、MDA、LDH、ROS水平显著性升高,GSH水平则显著降低,表明苍术素诱导细胞铁死亡;并且细胞凋亡率、cleaved-caspase3水平显著性升高,OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率、Ki-67水平显著降低,表明苍术素可以抑制脑胶质瘤细胞生长促进其凋亡。本研究中裸鼠移植瘤实验结果也表明,与模型组比较,苍术素组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积显著降低。提示苍术素可以抑制U251细胞增殖,促进其凋亡。

铁死亡是一种细胞死亡形式,其变化特征主要在于细胞中铁依赖性脂质过氧化物的积累。Nrf2是调节SLC7A11和GPX4表达的转录因子,其中GPX4是一种抗氧化防御酶,是细胞铁死亡的关键调节因子,抑制GPX4表达可促进癌细胞中的铁死亡。有研究表明,GPX4及其辅助因子GSH可以消除脂质过氧化,而胱氨酸/谷氨酸抗转运蛋白SLC7A11是GSH合成半胱氨酸的主要来源[19]。因此,可以推测Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路在细胞铁死亡过程中发挥关键作用。高世龙等[20]研究表明淫羊藿通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路进而抑制高糖诱导的小胶质细胞发生铁死亡。此外,Zhu等[21]研究表明甲斑螯素可以抑制Nrf2、GPX4表达进而降低卵巢癌细胞的恶性生物学进展。

本研究表明,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率显著性升高。ML385为Nrf2抑制剂,ML385组上述指标与苍术素高剂量处理组具有相同水平,提示苍术素通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路进而诱导细胞凋亡。裸鼠成瘤实验结果也表明,与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高。提示苍术素通过阻断Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路,进而抑制裸鼠肿瘤的生长。

综上所述,苍术素可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进脑胶质瘤细胞铁死亡,但其具体的分子机理还需进一步深入探讨。