马铃薯茎叶还田对土壤理化性质及细菌群落结构的影响

周远平,罗文娇,周 平,王 琼,郭华春

(1. 云南农业大学农学与生物技术学院,昆明 650201;2. 云南农业大学机电工程学院,昆明 650201)

【研究意义】中国南方大量种植马铃薯[1],收获后马铃薯茎叶常被薯农移出田地而未得到循环利用。马铃薯茎叶属于农作物秸秆的一种,其富含矿质养分和较多的纤维素和木质素[2],有效利用马铃薯茎叶是促进中国南方稻-薯轮作系统物质循环利用的重要手段。因而,明确马铃薯茎叶还田对土壤微生物群落结构及土壤理化指标的影响,对稻田的土壤养分和田间微生物群落管理具有重要意义。【前人研究进展】研究表明,土壤微生物群落结构对作物根系吸收土壤养分以及保证作物正常生长有着巨大的影响[3-4],作物秸秆还田可以增加土壤养分含量,提高微生物群落物种多样性和稳定性,从而改善土壤环境,有利于作物产量增加。麦秆连续还田后土壤碱解氮、有效磷、速效钾和有机质含量显著高于还田前土壤,且还田效果随还田年限的延长而逐渐提高[5],连续2年秸秆还田可以均衡耕作层土壤有机质分布,改良土壤环境[6]。细菌作为土壤微生物群落中数量最多且丰富度最高的微生物种群之一,其群落结构变化常被用作反映土壤质量的重要指标[7],还田秸杆的覆盖度50%可以使土壤微生物群落保持稳定水平,覆盖度70%可提高土壤微生物群落物种多样性[8]。【本研究切入点】目前关于马铃薯茎叶还田后,土壤理化性质和土壤细菌群落结构动态变化的研究鲜见报道,此外,土壤微生物群落的物种间互作网络分析成为表征微生物群落在群体水平上对不同农业措施响应模式的热点研究方向,可全面反映微生物群落的种间互作模式,而马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落种间互作关系的影响也鲜见报道。本研究在马铃薯茎叶还田后不同时间点采集并测定土壤样品部分理化指标的动态变化,并对在45、90 d时采集的土壤样品的细菌群落基因组16S核糖体DNA V3～V4区进行高通量测序,以分析土壤理化性质、细菌群落物种多样性、物种组成和物种共生网络对马铃薯茎叶还田的响应。【拟解决的关键问题】为解决中国南方地区马铃薯茎叶的资源化利用问题,通过分析马铃薯茎叶还田土壤和不还田土壤不同时期的土壤理化指标和土壤微生物群落结构的差异,明确马铃薯茎叶还田对土壤理化性质和土壤细菌群落结构的影响,为中国南方地区稻-薯轮作系统的物质循环和土壤微生物群落管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2021年在云南农业大学校内教学实验农场进行(102°42′ E,25°22′ N),海拔1920 m,属于亚热带季风性气候,全年干湿季分明。试验土壤类型为红壤,0～30 cm耕层土壤理化性质:pH 6.57、有机质24.70 g/kg、碱解氮86.49 mg/kg、有效磷22.68 mg/kg、速效钾115.71 mg/kg。

1.2 供试材料

供试马铃薯品种为滇薯23(D23)、滇薯1418(D1418),种薯由云南农业大学薯类作物研究所选育。

1.3 试验设计

D23和D1418采用盆栽种植(盆高30 cm,直径25 cm),每个品种种植100盆,于2021年3月17日播种,生长周期内进行一致的田间管理(盆栽土壤水分含量主要受自然降雨调节,盆内杂草手动及时拔除),并于2021年7月20日收获马铃薯。收获后分开收集D23、D1418茎叶,并铡为长度5 cm左右混匀备用。将2个品种的盆内土倒出混匀作为整个试验的背景土壤(处理CK)。试验设3个处理:D23茎叶还田(处理D23)、D1418茎叶还田(处理D1418)和不还田处理(处理CK),每个处理20盆。还田处理中取背景土壤与0.525 kg马铃薯茎叶混匀(按30 000 kg/hm2折算)后装盆,装土高度达花盆2/3处(约20 cm),再覆盖5 cm左右的背景土壤,不还田处理直接将背景土壤装至花盆5/6处(约25 cm)。

1.4 试验方法

1.4.1 土壤样品采集 2021年7月20日收获马铃薯块茎后,先采集处理CK土样(第0天),随后各处理每隔15 d(第15、30、45、60、75和90 天)分别采集花盆内15～20 cm土层的土样,用于分析土壤理化性质。同时,将第45天采集的土样分别设置为处理CK-1、D23-1、D1418-1,第90天采集的土样设置为处理CK-2、D23-2和D1418-2,用于分析马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落结构的影响。每个处理随机采集3个重复土样,装入无菌袋并放置在冰盒内运回实验室,将3个重复土样混匀后采用四分法分成2等份,一份于-80 ℃冰箱保存,用于提取土壤总DNA,另一份放置通风处自然风干,用于测定土壤理化指标。

1.4.2 土壤理化性质测定 土样风干后,分别研磨过2.000 mm和0.149 mm筛,参照Wen等[9]的方法分别采用pH计测定土壤pH;碱解扩散法测定土壤碱解氮含量;碳酸氢钠浸提钼锑钪比色法测定土壤有效磷含量;乙酸铵浸提火焰光度计法测定土壤速效钾含量;低温外加热重铬酸钾氧化-比色法测定土壤有机质含量。

1.4.3 土壤DNA提取及16S rDNA测序 选取马铃薯茎叶不还田(CK)、马铃薯茎叶还田后45 d(CK-1、D23-1、D1418-1)、90 d(CK-2、D23-2、D1418-2)3个时期的土壤样品用于分析土壤细菌群落结构差异。参照试剂盒提取土样基因组总DNA后,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量,采用细菌通用引物对16S rDNA基因V3～V4区进行PCR扩增,上游引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′),下游引物为806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化PCR产物,并用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)检测定量。使用 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 构建PE文库,采用Illumina Miseq PE300完成测序(上海美吉生物医药科技有限公司),利用软件UPARSE以97%的相似度对有效序列进行OUT聚类,使用软件UCHIME剔除嵌合体,比对Silva数据库,对OTU物种进行分类注释。

1.5 数据统计及分析

使用软件 Excel 2010统计和整理数据,使用DPS软件进行方差分析,利用美吉生信云平台(https://cloud.majorbio.com/)软件mothur进行物种组成分类注释和细菌群落物种多样性指数计算,利用R语言(version 3.3.1)工具进行数据统计和作图。利用R软件包ggClusterNet(version 0.1.0)进行土壤微生物群落物种共生网络构建及分析,其中,网络为物种相关性网络,相关性计算方法为spearman相关,相关性阈值为0.8,相关性显著性阈值为P=0.05,数据标准化方法采用“TMM”方法[10]。

2 结果与分析

2.1 马铃薯茎叶还田对土壤理化性质的影响

从表1可见,土壤pH随马铃薯茎叶还田时间的延长呈先降低后上升趋势,第30天时,茎叶还田处理显著高于处理CK。土壤有机质含量则随还田时间延长呈先升后降趋势,处理D23和D1418在第30天时均显著高于处理CK,比处理CK平均显著增加16%;第45、60、75、90天时,处理D23和D1418仍较处理CK有所增加,但差异不显著。土壤碱解氮含量在还田第60天时,处理D23最高,为227.27 mg/kg,比处理CK显著增加43.03%;第75天时,处理D1418最高,为225.17 mg/kg,比处理CK显著增加37.57%;第90天时,茎叶还田处理仍显著高于处理CK。土壤有效磷含量在还田第60天时处理D23和D1418均显著高于处理CK,第75、90天时,则有所降低。土壤速效钾含量随还田时间推移呈先升后降趋势,处理D23和D1418在第15天时达到整个还田时期最高值,分别为609.78、578.03 mg/kg,均显著高于处理CK,第30、45、60、75、90天时,处理D23和D1418仍显著高于处理CK。说明马铃薯茎叶还田可以小幅提高土壤pH,增加土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量。

表1 马铃薯茎叶还田对土壤理化性质的影响

2.2 马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落结构的影响

2.2.1 土壤细菌α多样性分析 利用Illumina高通量测序技术,分析土壤细菌群落结构α多样性。从表2可见,Coverage指数均高于0.97,表明此次分析的测序深度能代表土壤样品细菌群落的真实水平。在马铃薯茎叶还田第45、90天时,处理D23、D1418的Sobs值和Chao指数均高于处理CK-1、CK-2和CK(第0天);随着还田时间的延长,土壤细菌群落Shannon指数提高,Simpson指数降低,说明马铃薯茎叶还田处理提高了土壤细菌群落的物种丰富度和物种多样性。

表2 马铃薯茎叶还田后土壤细菌α多样性指数

2.2.2 土壤细菌群落物种组成差异分析 土壤细菌群落门水平的分类结果如图1所示,各处理相对丰度≥1%的有9个门,其他(others)为相对丰度<1%的菌群丰度之和。其中马铃薯茎叶还田(处理D23-1、D1418-1、D23-2、D1418-2)与不还田(处理CK、CK-1、CK-2)在门水平的细菌群落物种组成相似,各处理的优势菌门依次为放线菌门(Actinobacteriota,31.3%～36.8%)、变形菌门(Proteobacteria,18.4%～22.2%)、绿弯菌门(Chloroflexi,15.4%～17.6%)、酸杆菌门(Acidobacteriota,9.5%～14.5%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadota,4.5%～5.4%)、粘球菌门(Myxococcota,2.7%～3.7%)、拟杆菌门(Bacteroidota,2.1%～3.5%)、厚壁菌门(Firmicutes,1.7%～3.0%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirota,1.0%～1.2%)。还田第45、90天时,与不还田(处理CK)相比,还田处理的土壤细菌群落放线菌门、绿弯菌门相对丰度差异不显著,酸杆菌门相对丰度有所下降,变形菌门相对丰度则显著提高,其中处理D23-1、D1418-1比处理CK-1分别提高12.7%和4.1%,处理D23-2、D1418-2比处理CK-2分别提高12.5%和10.3%。

图1 马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落在门水平相对丰度的影响Fig.1 Effects of potato stem and leaf returning on relative abundance of soil bacterial community at phylum level

2.2.3 马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落β多样性的影响 利用Bray-curtis距离算法的主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)进一步分析属水平各处理中土壤细菌群落的物种组成差异。如图2所示,PC1和PC2分别解释了37.90%和19.11%的差异,马铃薯茎叶还田(处理D23-1、D1418-1、D23-2、D1418-2)与不还田(处理CK-1、CK-2)的Bray-curtis距离较远,表明茎叶还田处理的土壤细菌群落在属水平的物种组成与不还田处理差异较大;还田第0天(处理CK)、还田第45天(处理CK-1、D23-1、D1418-1)和还田第90天(处理CK-2、D23-2、D1418-2)土壤细菌群落物种组成的Bray-curtis距离较远,表明茎叶还田时间显著影响土壤细菌群落物种组成;而处理D23-1与D1418-1间的距离、处理D23-2与D1418-2间的距离较近,显示不同品种的马铃薯茎叶还田对土壤细菌属水平物种组成的影响较小。表明马铃薯茎叶还田处理显著改变土壤细菌群落的物种组成。

图2 马铃薯茎叶还田土壤细菌属水平物种组成PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of soil bacteria composition at genus level after potato stem and leaf returned to the field

2.2.4 土壤细菌群落物种组成差异分析 基于马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落β多样性的影响,马铃薯茎叶还田(处理D23-1、D1418-1、D23-2、D1418-2)和不还田(处理CK0、CK-1、CK-2)的土壤细菌群落在属水平的物种组成差异较大,进一步对还田处理(R treatment)和不还田处理(NR treatment)土壤细菌门到属水平的差异物种进行线性判别(LDA)分析,LDA阈值为3。如图3所示,不还田处理显著提高的差异菌群依次是Vicinamibacterales、微球菌科(Micrococcaceae)、节杆菌属(Arthrobacter)的物种;而还田处理显著提高的差异菌群依次是变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、粘球菌门(Myxococcota)、根瘤菌目(Rhizobiales)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、 Gemmatimonadaceae菌科、 粘球菌纲(Myxococcia)、粘球菌目(Myxococcales)、粘球菌科(Myxococcaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、Polyangia菌纲、原囊菌属(Archangium)的物种。表明在马铃薯茎叶还田处理土壤中显著富集并达到组间显著性差异的微生物菌群远多于不还田处理。

图3 土壤细菌丰度在马铃薯茎叶还田处理和马铃薯茎叶未还田处理中的线性判别效应分析Fig.3 LEfSe analysis of soil bacterial abundance between treatment with potato stem and leaf returning (R) and treatment without potato stem and leaf returning (NR)

2.2.5 马铃薯茎叶还田对土壤细菌群落物种共生网络的影响 分别对马铃薯茎叶不还田处理组和还田处理组土壤的微生物群落中物种丰度最高的前400个物种构建物种共生网络。如图4所示,还田处理土壤细菌群落物种共生网络的复杂度和稳定性显著高于不还田处理。同时,在还田处理组和不还田处理组土壤中,细菌群落物种间的互作均主要发生在酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria);然而,在马铃薯茎叶还田处理中,酸杆菌门、放线菌门和变形菌门参与互作物种数量显著高于不还田处理,且这3个菌门的物种同其他细菌门物种的互作强度在还田处理中也相应高于不还田处理;此外,马铃薯茎叶还田处理土壤细菌群落物种间的正负相关菌的互作强度也全面提高,特别是放线菌门和酸杆菌门物种间的互作强度显著提高(图4-a,4-b),马铃薯茎叶还田后,土壤细菌群落物种的共生网络的拓扑特征全面高于不还田处理(图4-c)。

a.马铃薯茎叶还田处理(R);b.马铃薯茎叶未还田处理(NR);c.还田处理较未还田处理土壤细菌群落共生网络拓扑特征的变化。a. Treatment with potato stem and leaf returning (R); b. Treatment without potato stem and leaf returning (NR); c. The variations of topological properties of networks of soil bacterial communities in the R treatment over which of the NR treatment.

2.3 马铃薯茎叶还田后土壤细菌群落结构与环境因子的相关性分析

对排名前20的土壤优势细菌门与环境因子进行Spearman相关性分析,再进行Average聚类。如图5所示,Latescibacterota、脱硫菌门(Desulfobacterota)与有效磷(Available P,AP)呈极显著负相关,与碱解氮(Available N,AN)、有机质(Organic matter,OM)含量呈显著正相关;放线菌门与AP含量呈极显著正相关;Bacteria菌门与AN含量呈极显著正相关;粘球菌门、Bdellovibrionota菌门与速效钾(Available K,AK)含量呈极显著正相关,髌骨菌门(Patescibacteria)、肠杆菌门(Entotheonellaeota)、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、变形菌门与AK含量呈显著正相关。

*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01);***表示差异极显著(P<0.001)。* means significant difference (P<0.05); ** means very significant difference (P<0.01); ***means very significant difference (P<0.001).

3 讨 论

3.1 马铃薯茎叶还田对土壤理化性质与细菌群落结构的影响

马铃薯茎叶还田可提高土壤微生物活性,促进土壤养分分解[11],加速有机物质矿化,提高土壤有机质含量。本研究中,与处理CK相比,马铃薯茎叶还田提高了土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量。这与吕凯飞等[12]在玉米秸秆还田后的结果一致。程曼等[13]研究表明,长期还田和秸秆直接还田可显著提高土壤有效氮和有效钾含量。王学敏等[14]和Hoffland等[15]研究表明,长期秸秆还田和秸秆还田结合氮肥减量施用可以增加土壤有机质、碱解氮和速效钾含量,这与本研究结果相似。土壤有效磷含量在还田第75、90天时较前期有所下降,一部分原因可能是试验区域9—10月降雨较多,在连续降雨的情况下,土壤有效磷淋溶到下层土壤所致[16]。土壤速效钾含量相比处理CK显著升高,马铃薯为喜钾作物[17],吸收钾元素后主要用于茎杆和块茎的生长发育,钾元素在马铃薯各器官中一般表现为在茎中含量最高[18],所以马铃薯茎叶还田后,茎叶腐解释放出钾元素,因而土壤速效钾含量显著提高。

土壤微生物可促进有机质矿化和影响土壤养分循环[19],是评价土壤生物学特性、衡量土壤肥力的关键指标。本研究中马铃薯茎叶还田第45、90天时土壤细菌物种丰富度和多样性显著提高,这与张玉洁等[20]的研究结果相似。进一步对马铃薯茎叶还田和不还田处理进行物种差异分析,发现茎叶还田处理在第45、90天时显著富集并达到组间显著性差异的细菌菌群共有12类,不还田处理中只有4类,可能是马铃薯茎叶还田后C/N适宜土壤细菌生长,茎叶腐解释放的养分利于土壤培肥,为土壤细菌的繁殖提供了充足的养分与能量[21-22]。本研究中,马铃薯茎叶还田在第45、90天时土壤变形菌门的相对丰度显著高于对照处理,酸杆菌门相对丰度较对照处理有所下降。土壤变形菌门广泛参与土壤氮素循环,是富营养型菌,能在有机质等营养元素较高的环境下较快生长[23],马铃薯茎叶腐解后,土壤碱解氮、有机质等养分含量增加,提高了土壤变形菌门的丰度;土壤酸杆菌门是一种嗜酸菌,属于贫营养型菌,富集在养分含量低的环境中,可以降解土壤有机物[24]。

微生物群落的物种间共生网络的物种组成和网络形态的变化,可直观展示不同处理对微生物群落的影响,本研究发现,马铃薯茎叶还田可提高土壤细菌群落物种的共生网络的复杂度和稳定性,表明马铃薯茎叶还田后土壤细菌群体的互作强度提高,其中正负相关菌群之间的互作强度均显著提高,不同细菌菌门间的互作强度也呈上升趋势,微生物群落处于可控状态,这表明马铃薯还田后的土壤微生物活性更强,对添加的茎叶具有更强的矿化能力[25-27],同时也对添加到土壤中的茎叶携带的微生物群体具有更强的调控作用,但是菌群的互作模式依然主要发生在酸杆菌门、放线菌门和变性菌门的细菌菌群之间。

3.2 土壤理化指标和细菌群落组成的相关性

土壤理化性质与土壤优势细菌群体存在相互作用,较多研究也表明土壤理化指标与土壤细菌群落间具有相互作用[28]。本研究中Latescibacterota菌门、脱硫菌门的菌群与AP呈极显著负相关,与AN、OM呈显著正相关。Latescibacterota是易感染青枯病的桑树品种植株耕层土壤中特有的优势菌门,脱硫菌门对盐度、pH和温度有广泛的适应性,属于厌氧细菌,在全球C、S循环中具有重要作用[29],赖政等[30]研究发现,稻虾种养模式中因小龙虾的觅食、挖掘等活动增加土壤透气性,增加根际土壤氧气供应,从而降低了土壤脱硫菌门相对丰度。本研究后期,降雨较多造成土壤结块,导致细菌脱硫菌门相对丰度提高,可能也是有效磷后期降低的原因。AK与粘球菌门、Bdellovibrionota菌门、髌骨菌门、肠杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和细菌变形菌门7个优势菌门呈显著正相关,表明马铃薯茎叶腐解后为土壤输送大量钾元素,补充了前期种植马铃薯所消耗的养分,利于细菌群落的生长和繁殖,与前人研究结果相似[4]。

4 结 论

马铃薯茎叶还田可以显著影响土壤pH,显著提高土壤有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量。在马铃薯茎叶还田第45、90天时,土壤细菌群落的物种丰富度、物种多样性显著提高,土壤群落物种间共生网络的复杂度及稳定性显著增强。