全氟辛酸对肉鸡肝脏和十二指肠的损伤作用

姚文梅,寇晨雨,孙雨昕,刘 涛,2,3,王晓丹,2

[1.河北农业大学中兽医学院,河北 保定 071000;2.河北省兽医生物技术创新中心,河北 保定 071000;3.瑞普(保定)生物药业有限公司,河北 保定 071000]

全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PFOA)是一类新型的持久性有机化合污染物。自20世纪50年代以来,PFOA因具有良好的表面活性和疏水疏油等特性,而被广泛用于生活用品和工业制造[1]。研究发现,PFOA暴露会诱导机体出现心血管疾病、遗传毒性、免疫毒性、慢性肾病、生殖毒性和肝脏毒性。近年来,全球范围内大气[2]、土壤[3]和水体[4]等环境介质以及畜产品中都能检出含有PFOA。Li等[5]测定了我国31个省级行政区域的79个城市饮用水样本中17种全氟烷基类化合物(Perfluoroalkyl acids,PFAAs)的水平,结果显示,中国饮用水中普遍存在PFAAs,∑17 PFAAs在4.49～174.93 ng/L范围内,平均值为35.13 ng/L。调查发现,河流和自来水中普遍存在PFOA、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonates,PFOS)、全氟己酸(Perfluorohexanoic acid,PFHxA)、全氟癸酸(Perfluorodecanoate,PFDA)和全氟戊酸(Perfluoropolyalkylether N,N-diphenylamide,PFPeA)[6]。Tan等[7]测定了我国东部地区作为饮用水主要来源的河流和湖泊中17种多氟烷基物质(Polyfluoroalkyl substances,PFASs)的浓度,饮用水中PFASs的总浓度为1.4～175.0 ng/L,但最令人担忧的是,杭州三区饮用水中PFOA浓度为115～151 ng/L。Bao等[8]研究发现,阜新地区某氟化物工业园区地下水样品中 PFOA 含量为2.47 μg/L,其温室旁土壤样品中 PFOA 含量为6.8 ng/g,温室内种植的番茄和黄瓜中 PFOA 浓度高达87和63 ng/g。PFOA不仅有很强的生物富集性[9],还可以通过食物链进行传递。研究发现,肉类产品中大部分含有PFASs,其中含量最多的是PFOA和PFOS。白润叶[10]对全国部分主产区1 445份鸡肉样品中PFASs进行调查,结果显示,PFOA含量位列第二,浓度为0.055 7 ng/g;随着对人群血清[11-12]、动物性食品(肉[13]、蛋[14]、奶[15]、水产[16])和生活饮用水[17]中PFOA含量进行检测分析,发现长期暴露于PFOA环境中对全球生态环境和人类健康都存在很大的威胁。

PFOA主要通过污染的饮水和食物进入机体并蓄积,进而对机体产生毒性作用。目前,关于PFOA的毒性研究主要集中于小鼠,对生产实践动物的研究较少。因此,本试验通过检测肉鸡生长性能和胸肌肉品质,肝脏和十二指肠中炎症因子,观察肉鸡肝脏和十二指肠形态变化,检测肝脏组织中转氨酶和抗氧化指标,以探究饮水中暴露不同质量浓度的PFOA对肉鸡生长性能、胸肌肉品质、肝脏和十二指肠的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 PFOA(纯度为95%),购自Sigma-Aldrich公司;丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)试剂盒、过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(Plasma glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒,均购自南京建成科技有限公司;白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)试剂盒、白介素-6(Interleukin 6,IL-6)试剂盒和肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor α,TNF-α)试剂盒,均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 主要仪器 Synergy HTX多功能酶标仪(BioTek,USA);Seven CompactTM多参数测试仪(梅特勒-托利多仪器有限公司);三恩驰NR60CP手持式色差仪(深圳市三恩驰科技有限公司)。

1.3 试验动物和分组 1日龄健康爱拔益佳肉鸡160羽,由天津静海庆源有限公司提供。将肉鸡随机分为4个组:0 mg/L PFOA组(C组)、0.5 mg/L PFOA组(D组)、1.0 mg/L PFOA组(Z组)和1.5 mg/L PFOA组(G组),每组4个重复,每个重复10羽。试验期间采用3层笼养,24 h恒定光照,自由采食和饮水,按正常免疫程序进行免疫接种。适应环境饲养3 d,第4天在饮水中添加不同质量浓度的PFOA,连续添加至42日龄。于42 d试验结束时,于每组中的每个重复随机选取4羽肉鸡,翅下静脉采血,处死后采取肉鸡的胸肌、肝脏和十二指肠,保存待测。

1.4 指标测定

1.4.1 平均日增重和肝脏指数 试验肉鸡1日龄和42日龄清晨空腹称重。按公式(1)计算平均日增重(Average daily gain,ADG)。将收集的肝脏用生理盐水冲洗,去除表面结缔组织和脂肪,称重,按公式(2)计算肝脏指数。

平均日增重=(末重-初始重)÷试验天数

(1)

肝脏指数(%)=肝脏重量(g)÷体重(g)×100%

(2)

1.4.2 胸肌肉品质和常规指标测定 取肉鸡左侧胸肌用于测定屠宰后24 h的肉品质和常规指标的测定,包括肉色、pH和蒸煮损失。

肉色:采用三恩驰NR60CP手持式色差仪,测定胸肌的亮度值(L*)、红度值(a*)和黄度值(b*)。同一样品测定3次,取平均值。

pH:将胸肌放入4 ℃冰箱保存,用Seven CompactTM多参数测试仪测定胸肌的pH,测定时将电极完全插入胸肌样品中。同一样品测定3次,取平均值。

蒸煮损失:剪下厚约3 cm、重约30 g的样品,剔除脂肪和结缔组织,装入蒸煮袋置于90 ℃水浴,测得胸肌样品中心温度为70 ℃时,取出并冷却至室温,用滤纸将表面水分吸干后称重,按公式(3)计算蒸煮损失。

蒸煮损失(%)=(样品煮前重-样品煮后重)÷样品煮前重×100%

(3)

1.4.3 肝脏中ALT和AST活力测定 将0.1 g肝脏组织和0.9 mL PBS匀浆后取上清,制备10%的肝脏组织匀浆。按照试剂盒说明书进行操作,测定肝脏中ALT和AST的活力。

1.4.4 肝脏和十二指肠组织病理学观察 将肉鸡的肝脏和十二指肠用4%多聚甲醛固定24 h。每组选取3份样品,经过修块,流水过夜,梯度酒精脱水,透明,浸蜡,包埋,制成5 μm石蜡切片,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色后于光学显微镜下进行组织病理学观察。取3张不同的十二指肠切片,每张切片选取6处走向完整的肠绒毛,用Image J图像分析软件测量绒毛高度(V)和隐窝深度(C),并计算V/C值。

1.4.5 肝脏氧化指标测定 将0.1 g肝脏组织和0.9 mL PBS匀浆后取上清,制备10%的肝脏组织匀浆。按照试剂盒说明书进行操作,测定肝脏中SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量。

1.4.6 肝脏和十二指肠中炎性因子含量测定 将0.1 g组织(肝脏或十二指肠)和0.9 mL PBS匀浆后取上清,制备10%的组织匀浆。按照试剂盒说明书进行操作,测定组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.5 数据分析 试验数据通过SPSS 19.0(Statistical Package for The Social Sciences,SPSS)软件进行单因素方差分析,若方差齐性,采用最小显著差异法(Least significance difference,LSD)检验;若方差不齐,采用Dunnett法检验。试验数据用“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,P>0.05表示无显著差异。

2 结果

2.1 PFOA对肉鸡平均日增重和肝脏指数的影响 由表1可知,饮水中暴露PFOA后能降低肉鸡的平均日增重,与C组(0 mg/L)相比,G组(1.5 mg/L)的平均日增重极显著降低(P<0.01)。饮水中暴露PFOA后能升高肝脏指数,与C组(0 mg/L)相比,Z组(1.0 mg/L)和G组(1.5 mg/L)的肝脏指数极显著升高(P<0.01),且呈剂量依赖性。

表1 PFOA对肉鸡平均日增重和肝脏指数的影响

2.2 PFOA对肉鸡胸肌肉品质和常规指标的影响 由表2可知,与C组(0 mg/L)相比,暴露于PFOA对屠宰后24 h的肉色(L*、a*、b*)和pH均无显著影响(P>0.05);与C组(0 mg/L)相比,仅G组(1.5 mg/L)屠宰后24 h的蒸煮损失显著升高(P<0.05)。

表2 PFOA对肉鸡胸肌肉品质的影响

2.3 PFOA对肉鸡肝脏中AST和ALT活力的影响 由图1可知,与C组(0 mg/L)相比,在饮水中暴露PFOA后,肉鸡肝脏中AST和ALT的活力都升高,其中Z组(1.0 mg/L)和G组(1.5 mg/L)的AST和ALT的活力都极显著升高(P<0.01)。结果表明,饮水中暴露PFOA会造成肉鸡肝脏损伤,且随着PFOA质量浓度增加,肉鸡肝脏中AST和ALT活力逐渐升高。

图1 PFOA对肉鸡肝脏中AST和ALT活力的影响

2.4 PFOA对肉鸡肝脏组织病理学的影响 如图2所示,C组(0 mg/L)肝细胞结构完整,细胞核清晰,无明显变性。饮水中暴露PFOA会破坏肉鸡肝脏组织的正常结构,其中D组(0.5 mg/L)肝索排列较整齐,肝细胞有空泡变性和细胞核固缩;Z组(1.0 mg/L)肝索结构紊乱,细胞发生空泡变性和细胞核固缩;G组(1.5 mg/L)肝索紊乱,肝细胞空泡变性并伴有炎性浸润。

图2 PFOA对肉鸡肝脏组织形态学的影响(400×)

2.5 PFOA对肉鸡十二指肠绒毛形态的影响 如图3所示,C组(0 mg/L)十二指肠绒毛形态结构完整,绒毛排列整;Z组(1.0 mg/L)和G组(1.5 mg/L)绒毛高度降低且绒毛出现水肿。如表3所示,与C组(0 mg/L)相比,在饮水中暴露不同质量浓度的PFOA后,十二指肠绒毛高度和隐窝深度及其比值均有极显著差异(P<0.01)。

图3 PFOA对肉鸡十二指肠绒毛形态的影响(200×)

表3 PFOA对肉鸡十二指肠绒毛高度和隐窝深度的影响

2.6 PFOA对肉鸡肝脏氧化指标的影响 如图4所示,与C组(0 mg/L)相比,D组(0.5 mg/L)肉鸡肝脏中SOD活性显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05);Z组(1.0 mg/L)和G组(1.5 mg/L)肝脏中SOD、GSH-Px和CAT活性极显著降低(P<0.01),MDA含量极显著升高(P<0.01)。

图4 PFOA对肉鸡肝脏氧化指标的影响

2.7 PFOA对肉鸡肝脏中炎症因子的影响 如图5所示,与C组(0 mg/L)相比,Z组(1.0 mg/L)肉鸡肝脏中IL-6含量显著升高(P<0.05),IL-1β和TNF-α含量极显著升高(P<0.01);G组(1.5 mg/L)肉鸡肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α含量都极显著升高(P<0.01)。

图5 PFOA对肉鸡肝脏中炎症因子的影响

2.8 PFOA对肉鸡十二指肠中炎症因子的影响 如图6所示,与C组(0 mg/L)相比,D组(0.5 mg/L)肉鸡十二指肠中TNF-α含量显著升高(P<0.05);Z组(1.0 mg/L)肉鸡十二指肠中IL-1β和TNF-α含量显著升高(P<0.05);G组(1.5 mg/L)肉鸡十二指肠中IL-1β、IL-6和TNF-α含量都极显著升高(P<0.01)。

图6 PFOA对肉鸡十二指肠中炎症因子的影响

3 讨论

PFOA的广泛存在对全球环境和人类健康存在严重威胁[18]。近几年研究发现,PFOA对机体的影响主要表现在生殖毒性[19]、神经毒性、肾脏毒性、心脏毒性和肝脏毒性等方面,而肝脏是机体最重要的代谢和解毒器官,也是PFOA毒性损伤作用的靶器官[20]。李丹阳等[21]研究妊娠期暴露PFOA对子代小鼠肝脏的损伤作用,发现PFOA可以极显著增加子代小鼠肝脏指数,导致肝细胞肿大,并发生空泡变性。胥梦晨[22]研究发现,PFOA可导致小鼠肝脏肿大并产生氧化应激,进而造成肝脏损伤。大量研究表明,PFOA引起的肝脏毒性与过氧化物酶体增殖物激活受体及其下游功能密切相关[23-24]。目前,饮水和饮食是机体暴露于PFOA的主要途径[25]。因此,本试验通过在肉鸡饮水中暴露不同质量浓度的PFOA,研究PFOA对肉鸡肝脏和十二指肠的损伤作用。

肝脏是动物机体能量供应、物质代谢和转换的主要器官。PFOA因其特殊结构,在体内难以降解,如果长期在机体中富集,就会对肝脏带来负面影响。有研究表明,暴露于PFOA可以诱发肝脏炎症,破坏抗氧化稳态,造成肝脏肿大,并最终导致肝脏损伤[26]。肝脏指数在一定程度上能够反映动物机体的健康状况。在本试验中,与C组(0 mg/L)相比,PFOA组中肉鸡肝脏指数逐渐增加;其中,Z组(1.0 mg/L)和G组(1.5 mg/L)肝脏指数极显著增加。AST主要存在于心肌、线粒体和肝细胞胞浆中,ALT主要分布在肝细胞胞浆中,因此,肝脏中AST和ALT的水平可以反映肝脏的受损程度。本试验饮水中暴露PFOA后,肉鸡肝脏中AST和ALT的活力随着PFOA浓度的增加而上升。大量研究表明,PFOA能导致哺乳动物肝细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平上升[27-28]。当机体长时间暴露于高氧环境而导致ROS水平超过肝细胞抗氧化能力时,肝细胞就会遭受到氧化应激损伤。SOD、CAT和GSH-Px是机体清除自由基的抗氧化酶,在防止细胞氧化损伤方面起着重要的作用。MDA是机体脂质过氧化过程的最终产物,具有细胞毒性,其含量可以直接反映出机体脂质过氧化和细胞损伤的程度。本试验结果显示,暴露于PFOA肉鸡的肝脏组织中SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶活性降低,MDA含量升高,这可能是因为PFOA在体内积累,诱导过量的ROS产生从而导致肝脏发生氧化损伤。

小肠是动物机体营养物质消化吸收的主要场所。肠黏膜的形态、结构和功能的完整性是维持肠道健康的有效屏障[29]。Rashid等[30]研究发现,给予CD1小鼠PFOA[1、5、10和20 mg/(kg·bw·d)]10 d后,小鼠的小肠和结肠组织中会积累大量的PFOA;与结肠相比,小肠中PFOA的蓄积水平更高,并且肠道上皮内层的结构完整性和功能受到影响。小肠绒毛是机体吸收营养的主要途径,绒毛高度和隐窝深度是衡量肠道黏膜功能的重要指标:小肠绒毛高度越高,说明肠上皮细胞发育越好,可以增加与肠道内容物的接触面积,促进消化酶的合成和分泌;小肠隐窝深度可以反映出上皮细胞的增殖速度,隐窝越浅,说明小肠上皮细胞增殖越快,有利于更好的吸收营养物质。本试验结果显示,在饮水中暴露PFOA可导致肉鸡十二指肠绒毛高度变低、隐窝深度变深、绒毛高度与隐窝深度比值降低,并且绒毛肿胀,最终破坏了十二指肠的形态结构和功能。

炎症反应是机体对各种刺激所发生的防御反应。通常来说,炎症对机体是有益的:当机体受到损伤和感染时,可通过炎症反应来促进组织的恢复,起到一种自我保护的作用。有研究表明,PFOA能够增加肝脏中促炎因子IL-6的表达,从而诱导机体发生炎症反应[31]。IL-1β主要由单核细胞产生,可引起机体局部发生炎症反应。IL-6可由多种免疫细胞合成和分泌,影响着T细胞的分裂和B细胞的增殖,并且参与肝脏细胞和肠黏膜上皮细胞的免疫反应。TNF-α是目前发现的生物活性因子之一,主要由单核巨噬细胞产生,其可以促使一氧化氮和趋化因子等产生,加剧机体炎症的发生。本试验结果显示,饮水中暴露PFOA会使肉鸡肝脏和十二指肠中促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量升高,从而导致肝脏和十二指肠发生炎症反应。

肉品质的测定主要包括肉色、pH、蒸煮损失、滴水损失和嫩度等指标。在指标测定中,L*表示亮度,L*值越低,颜色越浅,肉质越好;a*值表示肌肉的红度;b*值表示肌肉的黄度。pH对肌肉的颜色、保质期和系水力等均有影响,是评价肉品质性状的重要指标之一[32]。肌肉系水力是指肌肉保水能力,通常用蒸煮损失和滴水损失进行评估,一般蒸煮损失越低,系水力越高,肉质越好。本试验结果显示,饮水中暴露PFOA对肉色和pH无显著影响,G组(1.5 mg/L)蒸煮损失显著增加,说明PFOA会降低肉鸡胸肌的保水性能。

目前,环境中存在的是PFAS的混合物,而不是单独的物质,因此应更好地了解PFAS的联合效应对我国畜禽业发展的影响。后续试验应进一步探究PFAS暴露于饮水后对家禽生长性能、肉品质的影响以及在机体内残留等问题。综上所述,饮水中暴露PFOA会对肉鸡的肝脏和十二指肠造成损伤,其中1.5 mg/L的PFOA会增加肉鸡胸肌蒸煮损失,导致肉鸡肝脏细胞损伤和炎症反应,使抗氧化能力降低;且导致肉鸡十二指肠绒毛变短、水肿和炎症反应。