骨髓脂代谢紊乱与原发性骨质疏松症的关系及临床意义研究

张靖嫔，罗锦辉，邱明林

原发性骨质疏松症（osteoporosis， OP）是一种以骨量减少和骨组织微结构退化为特征的慢性骨病，是骨脆性和骨折风险升高的重要因素之一［1］。流行病学调查结果显示，OP 在各个人群中都可能发生，我国50 岁以上人群OP 患病率女性为20.7%，男性为14.4%，但绝经后女性和老年男性的OP 发病率明显升高［2-5］。近年来，随着我国老龄人口的比例增加，OP 已成为老年人群致残和致死的主要危险因素之一，同时严重影响老年人群的生活质量，因此，OP 的治疗和预防已成为一个重要的公共卫生和临床医学问题［6］。随着现代医学的发展，OP 发病机制研究和治疗方案有了长足进步，然而其发病机制目前仍不十分明确，为OP 的精准治疗和个性化预防方案的制定造成一定的阻碍。因此，积极探索OP的发病机制仍是该领域重要的热点问题和战略任务之一。

近年来，相关研究显示，骨量减少或OP 与骨髓脂代谢紊乱常存在普遍的并存现象，二者深层关系也受到越来越多的关注［7-9］。脂代谢涵盖的指标较多，脂代谢异常的定义也比较广泛。脂代谢紊乱是高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病的直接危险因素。目前研究认为，高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病与OP 具有密切联系，提示（骨髓）脂代谢紊乱可能是OP 的间接危险因素［10-11］。另有证据表明脂代谢紊乱可以直接导致骨髓脂肪增多，进而引起骨髓微循环障碍和骨量减少，这即为骨髓脂代谢紊乱形成的基本过程［12-14］。但上述OP 与脂代谢关系的机制假说仍需进一步深入证实。

为进一步探明骨髓脂代谢紊乱对OP 发生和发展的影响和作用机制，本研究利用基因组学数据，分析脂代谢相关基因在OP 患者骨髓间充质干细胞基因组学范围内的表达特点，了解骨髓脂代谢紊乱对OP 影响及临床意义，为OP 的预防和治疗提供基因组学证据。

1 资料与方法

1.1 资料来源 在美国国立生物技术信息中心GEO 数据库下载获得基因芯片数据GSE35959（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE35959），该数据集研究设计类型为病例对照研究，标本来源为与OP 关系紧密的骨髓间充质干细胞。本研究将标本分为2 组，OP 组（n=5）和健康对照组（n=14）。OP 组共5 例，其中男性2 例，女性3 例，年龄（86.20 ± 5.66）岁；健康对照组共14 例，其中男性2 例，女性12 例，年龄（64.07 ±13.90）岁。

1.2 差异表达基因分析 采用R 软件（4.1.3 版）的Limma 包对数据集进行预处理，并进行标准化；然后获得原发性OP 骨髓间充质干细胞的差异表达基因（differentially expressed genes， DEGs），筛选标准为llog2Fold Changel＞ 2，FDR＜0.05。

1.3 人类脂代谢基因的获取 从Molecular Signature Database v5.1（MSigDB）中综合收集751 个脂代谢相关基因。然后与OP 的DEGs 取交集，获得OP患者差异表达的脂代谢基因列表。

1.4 富集分析 本研究使用R 软件在KEGG 数据库（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）获取最新的KEGG Pathway 和GO 注释，以此作为背景，将OP 脂代谢基因集映射到背景集合中，使用R 软件包cluster Profiler 进行富集分析，以获得基因集富集的结果。设定最小基因集为5，最大基因集为5 000，FDR＜0.05 为有统计学意义。

1.5 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的建立 将OP 差异表达的脂代谢基因列表上传至STRING 数据库（https：//cn.string-db.org/）建立PPI 网络，信度参数设定为0.700。

1.6 统计学处理 筛选PPI 网络中重要的HUB 蛋白（互作关系≥5 的节点），采用受试者操作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲线分析评估HUB 蛋白鉴别诊断OP 的敏感度和特异度，并采用Pearson 相关性分析上述重要HUB 蛋白表达在OP 患者中是否具有关联，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DEGs 分析 与健康对照组相比，在OP 患者骨髓间充质干细胞中，共鉴定出2 105 个DEGs，其中上调基因1 940 个，下调基因165 个，火山图和聚类热图见图1A、1B。在2 105 个OP-DEGs 中，共有75 个与脂代谢相关的DEGs，见图1C。

图1 OP 患者间充质干细胞DEGs 的筛选和表达模式

2.2 OP 脂代谢相关基因的富集分析 OP 脂代谢相关基因的GO 富集分析结果显示：OP 脂代谢相关基因参与机体的各种脂代谢过程，包括细胞脂代谢、小分子脂代谢、脂质合成、脂肪酸代谢等过程。由此可见，OP 脂代谢相关基因参与机体脂代谢的途径复杂、精细，值得进一步证实。KEGG富集分析结果表明，OP 脂代谢相关基因主要涉及花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、PPAR 信号通路、α-亚麻酸代谢、醚脂代谢、卵巢类固醇生成、胆固醇代谢、亚油酸代谢、甘油脂代谢等信号通路。见图2。

图2 OP 脂代谢相关基因的富集分析结果

2.3 OP 脂代谢相关基因PPI 网络的建立 PPI 网络共包含75 个节点，65 条互作关系（P＜0.01）；其中互作关系≥5 的节点为7 个，分别为HELZ2、CYP4A11、ALOX5、PTGS2、CYP4F2、ALOX12B、FABP4，互作关系最多的为HELZ2。OP 脂代谢相关基因PPI 网络见图3。

图3 OP 脂代谢相关基因的蛋白-蛋白互作网络

2.4 HUB 脂代谢相关基因的表达水平 OP 患者7 个HUB 基因的表达水平高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示OP 患者的脂代谢水平存在升高的趋势。OP 脂代谢相关基因PPI 网络中的7 个HUB 脂代谢基因的表达水平分析见图4。

图4 OP 脂代谢相关基因的表达水平比较

2.5 OP 脂代谢相关基因的相关性分析 OP 脂代谢相关基因PPI 网络中的7 个HUB 基因与OP 患者的相关性分析发现，ALOX5 基因与HELZ2 基因表达呈负相关（P＜0.05）。见图5。

图5 OP 脂代谢相关基因的相关性分析

2.6 脂代谢相关基因对OP 的鉴别 PPI 网络中的7 个HUB 基因鉴别OP 的ROC 曲线分析发现，HELZ2、CYP4A11、ALOX5、PTGS2、CYP4F2、ALOX12B、FABP4 基因对OP 均具有一定的鉴别意义，曲线下面积均＞0.8，有统计学意义（P＜0.05）。见图6 和表1。

表1 OP 脂代谢相关基因鉴别OP 的ROC 曲线各指标

图6 OP 脂代谢相关基因鉴别OP 的ROC 曲线

3 讨论

OP 是一种慢性全身性骨骼疾病，其病理特征为骨量减少、骨密度降低及骨微观结构改变，导致骨折风险增加。目前，全球OP 患者超过2 亿人，其发病率位居常见病的第7 位，已成为世界公认的公共卫生问题［4,15-17］。OP 成为我国第4 大常见慢性病，其发病率和患者人数均随人口老龄化趋势而升高［6］。据调查，我国50 岁以上人群中，约40%的女性和13% 的男性在其老龄阶段至少发生1 次骨折［18-19］。目前，针对OP 病因机制制定的干预治疗方案临床上已达成共识。然而，虽然近年来OP 的治疗和预防手段越来越先进，但其发病机制仍不十分明确，影响其防治效果进一步改善。因此，OP 的预防和治疗已成为医务工作者重要的工作任务之一。

目前，对OP 发病机制的研究主要集中在成骨细胞和破骨细胞的生成和功能平衡、雌激素缺乏等方面。近年来，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stromal cells， BMSCs）与脂肪细胞的关系受到越来越多的关注。目前，该领域的研究发现，BMSCs 向脂肪细胞转化增速，使骨髓内脂肪细胞数目不断增多，体积逐渐增大，直接导致骨髓腔内微环境发生改变，造成骨髓脂代谢紊乱；同时BMSCs 向成骨细胞的分化减少，破骨细胞的形成增多和功能活化，二者之间的功能平衡被破坏，最终导致OP［12-13］。另有学者认为，机体雌激素等水平变化后，可加速运动员脂肪分解，总胆固醇和三酰甘油水平升高，诱发高脂血症，提高OP 发生的风险，这一关系已得到证实［10-11,20］。近年来，在临床上，OP患者常伴有脂代谢紊乱，同时，部分OP 患者应用降血脂药物的同时骨密度升高。由上述证据可见，骨髓脂代谢紊乱在OP 发病机制中起着重要作用，但其具体的调控机制复杂，仍需深入探索。

本研究基于基因组学数据，采用基因组学分析技术，探讨了脂代谢基因在OP 患者骨髓间充质干细胞中的表达情况，并建立了PPI 网络，探讨关键基因对OP 的指示意义。分析结果显示，75 个脂代谢相关的基因在OP 患者骨髓间充质干细胞中异常表达，提示这些基因参与了OP 患者骨髓脂代谢紊乱过程。此过程中，OP 脂代谢相关基因主要参与了细胞脂代谢、小分子脂代谢等更加精细的脂代谢过程，并涉及甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢等信号通路。上述分析结果提示，骨髓脂代谢紊乱是一个更加复杂、精细的过程，可涉及多条信号通路。随后笔者建立了OP 差异表达的脂代谢相关基因的PPI网络，该网络的核心节点为HELZ2，互作关系≥5 的节点的蛋白在OP 患者骨髓间充质干细胞中均呈高表达，进一步证实OP 患者均存在骨髓脂代谢紊乱现象。

HELZ2 基因编码的蛋白质是过氧化物酶体增殖物激活受体α 的核转录共激活因子，包含一个锌指，是一种解旋酶，可能是过氧化物酶体增殖物激活受体α 相互作用复合物的一部分［21-22］。该蛋白位于OP 脂代谢相关基因的PPI 网络的中心，提示在OP 患者骨髓脂代谢紊乱过程中，可能存在复杂的氧化应激过程。ALOX5 基因编码的花生四烯酸5-脂氧合酶是炎症介质白三烯和脂氧素生成旁路的一个起始催化酶［23-25］。OP 患者ALOX5 和HELZ2基因表达升高，二者存在负相关，提示OP 患者骨髓脂代谢紊乱过程是一个脂氧代谢平衡紊乱的过程，有待进一步深入探究。

综上所述，OP 患者机体存在骨髓脂代谢紊乱，脂代谢相关基因对上述过程具有一定的调控作用，本研究筛选的7 个重要的脂代谢相关基因对OP 具有一定的鉴别诊断能力，为OP 的预防、诊断和治疗提供了重要参考。