六味地黄丸对阿尔茨海默病秀丽隐杆线虫模型的神经保护作用

雷 霞，王加朋，佟玉良，张金凤，苏 婷，于 浩，金美玲，徐红丹，张 宁∗

（1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏省中医退行性骨关节病临床医学创新中心，江苏 无锡 214071；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 3.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007； 4.无锡卫生高等职业技术学校，江苏 无锡 214028）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） 是一种与年龄相关的中枢神经系统疾病，目前AD 患者已超过3 500 万人［1］。有研究表明，在受AD 影响的海马神经元中，常出现线粒体功能障碍和生物能量缺陷，而这些异常在出现AD症状之前就已经存在。线粒体功能障碍导致细胞能量缺陷和氧化损伤引发Aβ 沉积，进一步导致认知缺陷［2］。因此，保护线粒体功能是治疗AD 的重要策略。

六味地黄丸源自《小儿药证直诀》，具有滋阴补肾之功效。有研究表明，六味地黄丸在治疗AD 方面具有显著的疗效［3-5］。实验研究也发现，六味地黄丸对氢化可的松和侧脑室注射Aβ25-35构建的老年痴呆症状有改善作用［6］。课题组前期已经证明六味地黄丸具有神经保护作用，且可能与调节脑能量代谢密切相关［7］。秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans不仅具有体积小、生命周期短、易于培养和观察等特点，而且其组成以神经元细胞为主，几乎所有涉及哺乳动物神经元功能的基因家族都存在于线虫中，这使得线虫更易于用作探究神经元水平的能量代谢情况［8］。因此，本研究以C.elegans为实验对象，探索六味地黄丸对神经元线粒体损伤的保护作用机制，从能量代谢衰竭学说角度寻找安全可靠的抗AD 中药。

1 材料

1.1 实验动物 秀丽隐杆线虫，CL2355 （转染人源Aβ 基因） 品系、CL2122 （野生型） 品系线虫株均购自明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）。

1.2 试剂与药物 六味地黄丸浓缩丸、盐酸二甲双胍片（北京同仁堂药店哈尔滨店）。Phospho-AMPKα （Thr172）抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号AA393）；Anti-SIRT1、Anti-β-actin 抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号PB0173、BM3873）； TRIzol 总RNA 提取试剂（美国赛默飞世尔科技公司，批号223306）； FastKing cDNA第一链合成试剂盒（去基因组） ［天根生化科技（北京）有限公司，批号U8819］。

1.3 仪器 电泳仪、半干转膜仪（美国伯乐公司，型号PowerPacTMHC、PowerPacTMBasic）； 实时荧光定量PCR 仪（美国安捷伦科技有限公司，型号Mx3000P）； 生化培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司，型号ZSD-1160）； 荧光倒置显微镜、体式显微镜 （日本奥林巴斯公司，型号IX71、SZ-51）。

2 方法

2.1 实验分组 实验分为空白组（CL2122 型）、模型组（CL2355 型）、阳性药组（CL2355 型，50 mmol/L 二甲双胍） 和六味地黄丸低、中、高剂量组（CL2355 型，0.5、1.0、2.0 mg/mL）。

2.2 溶液配制

2.2.1 六味地黄丸提取物的制备 取六味地黄丸浓缩丸，研细，取96 g 置于烧杯中并加入500 mL 80%乙醇，搅拌，超声提取1 h，回流萃取2 次，每次30 min，将浓缩液冻干，得到六味地黄丸提取物冻干粉。研究表明80%六味地黄丸乙醇提取物中含有没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、山茱萸新苷、丹皮酚等主要有效成分。考虑尽量除杂和尽可能多地保留有效成分，本实验采用80%乙醇对六味地黄丸进行萃取。

2.2.2 六味地黄丸含药培养基的配制 精密称取六味地黄丸提取物100、200、400 mg，分别加至200 mL 灭菌的50 ℃线虫生长培养基（NGM） 中，摇匀，使终质量浓度分别为0.5、1、2 mg/mL。取上述药液100 mL 于灭菌的培养皿中，冷却凝固为含药培养基； 另外100 mL 加入大肠杆菌，制备含药菌液。取20 μL 含药菌液滴在培养基中心位置，置于37 ℃恒温下培养12～14 h，15 ℃下贮存。本实验直接将六味地黄丸冻干粉加入配制好的约50 ℃的NGM 培养基中。NGM 培养基配制时已加入无水乙醇助溶，故六味地黄丸粉末可完全溶于培养基中。

2.2.3 二甲双胍含药培养基的配制 取盐酸二甲双胍片，碾碎，精密称取1.656 3 g，加到200 mL 灭菌的50 ℃NGM培养基中，按照“2.2.2” 项下六味地黄丸含药培养基、含药菌液的制备步骤进行配制。二甲双胍溶于水，其粉末亦可在NGM 培养基中溶解，故无需考虑溶酶介质的影响。

2.2.4 OP50 细菌的培养 在细菌培养板上挑取大肠杆菌OP50 单菌落至5 mL 的LB 液体培养基中，37 ℃培养过夜。细菌的分离纯化步骤为取200 μL 菌液于LB 固体培养基上，用灭菌的涂布器涂布均匀，37 ℃培养过夜。培养OP50 作为线虫的食物，待平板上长出单菌落后，用灭菌的接种环挑取单菌落至200 mL LB 液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养24 h。

2.2.5 NGM 配制 取蛋白胨（peptone） 2 g、琼脂16 g、NaCl 2.4 g，置于洁净1 000 mL 玻璃三角瓶，加入1 mol/L磷酸缓冲液20 mL，蒸馏水定容至800 mL （此混合物为初始培养基），120 ℃高压蒸汽灭菌30 min，置于55 ℃水浴锅中冷却，依次加入5 mg/mL 胆固醇（无水乙醇溶解，不灭菌） 0.8 mL，高压灭菌的1 mol/L MgSO4、1 mol/L CaCl2各0.8 mL，摇匀即得到完全培养基。

2.2.6 含菌NGM 培养基配制 取200 μL OP50 菌液于NGM 平板上，用灭菌的涂布器轻轻地涂布均匀，涂布时使菌苔距离平板2 cm 左右，涂布完毕后，室温放置菌液干透，转至20 ℃培养箱中倒置培养过夜，使培养基上长出一层薄薄的菌苔。

2.3 行为学实验 野生型线虫对NaCl 具有趋向性，在饥饿和NaCl 这2 种条件的刺激下，线虫会避开NaCl。NaCl趋向性分析实验装置是含有NGM 培养基的直径6 cm 的普通培养皿，也称为趋向性检测皿。每组随机抽取50 只线虫，用M9 缓冲液洗净后，将其移至不含食物的新鲜驯化皿或模拟条件驯化皿上，在20 ℃下进行4 h 的驯化，然后将其洗脱移至检测皿中。取含100 mmol/L NaCl 的圆柱状琼脂块，移至检测皿上A 点，在培养基上产生连续的NaCl梯度。14 ～24 h 后移走该琼脂块，在A 点加入1 μL 0.5 mol/L NaN3。将检测皿放置在20 ℃条件下，让线虫自行活动30 min，最终求出趋向指数（CI），公式为CI ＝ （NANB） /（NAll－NC），NA表示A 区，NB表示B 区，NC表示C 区，NAll表示检测皿中所有线虫数目，线虫化学趋向性检测皿示意图见图1。实验平行重复3 次。

图1 线虫化学趋向性检测皿示意图

2.4 Western blot 法检测线虫体内p-AMPK、SIRT1 蛋白表达 严格按照蛋白提取试剂盒说明提取线虫蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。各组蛋白上样量均为25 μg，进行SDSPAGE 凝胶电泳，然后将其转移至PVDF 膜，加5% 脱脂奶粉溶液在室温下封闭1.5 h，加SIRT1、p-AMPK、βactin 抗体（1 ∶1 500），于4 ℃下孵育过夜，TBST 清洗3次，每次10 min，加二抗（1 ∶5 000） 室温孵育1.5 h，TBST 清洗3 次，每次10 min，滴加发光液，显影、成像，采用凝胶成像系统拍照，分析目的蛋白相对表达。

2.5 RT-qPCR 法检测线虫体内paqr-1、aak-1、sir-2.1 mRNA 表达 取同步化至L4 期的线虫，M9 缓冲液洗2 次，TRIzol 法提取总RNA，然后使用Fast King RT Kit （With gDNase） 将RNA 反转录为cDNA。使用Super Real Pre Mix Plus （SYBY Green） 实时荧光定量PCR 试剂盒检测paqr-1、aak-1、sir-2.1 mRNA 表达。引物应用核酸系列保守区内设计，引物长度20～22 bp，G＋C 含量45% ～55%，碱基随机分布，引物利用NCBI 软件设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.6 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步比较采用LSD 和SNK 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 六味地黄丸提取物对AD 模型线虫化学趋向性的影响 如图2 所示，在缺乏食物和暴露于NaCl 的条件下（＋NaCl； -E.coli），与空白组比较，模型组线虫对NaCl 的趋向性升高（P＜0.01），学习记忆行为受到抑制； 与模型组比较，阳性药组和六味地黄丸中、高剂量组线虫NaCl 的趋向性降低（P＜0.01），联想性学习行为得到修复。而在缺乏食物和NaCl 的条件下（-NaCl； -E.coli），与空白组比较，模型组线虫对NaCl 的趋向性降低（P＜0.01），学习记忆行为受到抑制； 与模型组比较，阳性药组和六味地黄丸中、高剂量组线虫对NaCl 的趋向性升高 （P＜0.05，P＜0.01），学习记忆行为得到修复。

图2 六味地黄丸提取物对AD 模型线虫化学趋向性的影响（±s，n＝50）

3.2 六味地黄丸提取物对AD 模型线虫AMPK、SIRT1 蛋白表达的影响 如图3 所示，与空白组比较，模型组p-AMPK 和SIRT1 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和六味地黄丸中、高剂量组p-AMPK 与SIRT1 蛋白表达升高（P＜0.01）。

图3 六味地黄丸提取物对AD 模型线虫p-AMPK、SIRT1 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

3.3 六味地黄丸提取物对AD 模型线虫aak-1、sir-2.1 和paqr-1 mRNA 表达的影响 如图4 所示，与空白组比较，模型组aak-1、sir-2.1、paqr-1 mRNA 表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性药组和六味地黄丸中、高剂量组aak-1、sir-2.1、paqr-1 mRNA 表达升高（P＜0.01）。

图4 六味地黄丸提取物对AD 模型线虫aak-1、sir-2.1、paqr-1 mRNA 表达的影响（±s，n＝3）

4 讨论

AD 患者常出现记忆减退，本研究以转染人源Aβ 基因的秀丽隐杆线虫为AD 模型［9］，通过化学趋向性实验考察线虫学习记忆能力，发现AD 模型线虫出现联想学习记忆能力障碍，而六味地黄丸能够改善症状。在明确六味地黄丸能够有效改善记忆障碍的前提下，本实验深入研究其抗AD 作用机制。

线粒体功能障碍是AD 发病机制的早期事件，线粒体在延缓衰老和预防神经退行性疾病方面发挥着重要作用［10］。有研究表明，线粒体功能障碍和能量代谢缺陷是在人类AD 中持续存在的特征。在AD 大脑中可观察到能量产生减少、耗氧量降低、复合体Ⅰ和Ⅳ活性下降。在AD 转基因小鼠和过量表达Aβ 的线虫等模型生物中也观察到类似的代谢变化［11-12］。脂联素（adiponectin，APN） 是一种能够发挥神经保护、调节能量代谢的脂肪因子，其表达情况与线粒体功能相关［13］。脂联素受体1 （adiponectin receptor 1，AdipoR1） 作为APN 重要受体之一［14］，在神经元的细胞膜上广泛表达［15］。AdipoR1 可以激活AMPK，调节能量代谢［16］，也可以激活SIRT1，诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅助活化因子-1α （PGC-1α） 去乙酰化［17］，发挥调节能量代谢的作用。本实验结果显示，六味地黄丸提取物能够上调AD 模型线虫AdipoR1 基因表达，可能是通过提高脂联素受体表达进而激活下游途径相关分子表达生物活性，发挥神经保护作用。

腺苷酸活化蛋白激酶 （AMP-activatedproteinkinase，AMPK） 是APN 信号的主要下游组成部分，可感知细胞的ATP 水平变化［18］。在低能量条件下，AMPK 通过磷酸化特定的酶与生长控制节点来增加ATP 的生成和减少ATP 的消耗。AMPK 能调节细胞内线粒体网络的形状，刺激线粒体生物发生来控制线粒体数量，以及通过调节自噬和有丝分裂来控制线粒体质量［19］。在AD 中，AMPK 可以通过调节β 和γ 分泌酶的表达以减少Aβ 的沉积，从而改善痴呆症状和异常的大脑能量代谢［20］。

沉默信息调节因子 1 （ silentinformationregulator1，SIRT1） 存在于细胞核和细胞质中。SIRT1 能增加线粒体生物发生、降低氧化应激［21］，并且可以通过对PGC-1α 的去乙酰化来抑制PPARγ 表达，调节体内重要脏器的能量代谢［22］。AMPK 与SIRT1 在细胞稳态的调节中关系紧密，AMPK 通过增加细胞NAD＋水平来增强SIRT1 活性，从而实现下游SIRT1 靶标的脱乙酰化和调节［23］。由本实验结果可知，六味地黄丸组p-AMPK、SIRT1 蛋白和mRNA 表达均升高，提示六味地黄丸提取物在激活AD 模型线虫AdipoR1 后进一步激活了下游的AMPK 和SIRT1 通路，发挥神经保护作用。

综上所述，本研究发现六味地黄丸提取物可通过增强AD 模型线虫AdipoR1 表达，激活AMPK/SIRT1 信号通路调节能量代谢，改善神经元线粒体功能，发挥神经保护作用。以秀丽隐杆线虫为模式生物研究中药、中药复方防治AD具有一定的可行性，特别是从神经元能量代谢角度深入挖掘机制。