二至丸改善自然衰老大鼠卵母细胞线粒体功能的机制研究*

上海中医药大学附属第七人民医院 妇产科

益敏辉 王永峰 郝小白 唐 虹 李林霞(上海 200137)

提要 目的：研究二至丸对自然衰老大鼠卵母细胞线粒体改善的效应与机制。方法：选用SPF级SD雌性大鼠，随机分为8周龄青年对照组、20周龄老年对照组、20周龄二至丸用药低剂量组和高剂量组。用药30 d后，进行腹腔注射孕马血清促性腺激素(20 IU/只)，2 d后给予人绒毛膜促性腺激素(10 IU/只)，干预12 h后观察卵母细胞腺苷三磷酸(ATP)、活性氧(ROS)含量及线粒体的数目、形态，检测线粒体动态调控蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)、视神经萎缩蛋白1(OPA1)、PTEN诱导蛋白激酶1(PINK1)的蛋白表达水平。结果：和青年对照组相比，老年对照组卵巢卵母细胞ATP的含量减少(P<0.05)，细胞内线粒体数量下降，结构紊乱，部分呈空泡化，PGC-1α、OPA1及PINK1蛋白水平下降(P<0.05)；二至丸低、高剂量组可提高老年大鼠卵母细胞ATP的浓度(P<0.05)，增加细胞内线粒体含量、改善结构及减少ROS的生成(P<0.05)，促进PGC-1α、OPA1和PINK1的表达(P<0.05)。结论：二至丸可以改善衰老卵巢内的卵母细胞线粒体的结构和功能，提高线粒体自我更新以达到修复自然衰老卵母细胞的作用。

衰老是机体的一种自然生理现象，任何生物都无法避免，是机体随着时间的推移导致器官的形态和功能出现不可逆的衰退。女生生殖系统的衰老会引起卵泡的数量降低、质量下降以及雌激素分泌不足等一系列症状，影响着女性的身心健康。衰老的速度是否影响卵巢的储备功能，是目前研究的重点。

中医常用补肾类方药来治疗或延缓衰老相关疾病。由女贞子和旱墨莲构成的经典名方二至丸，功效是补益肝肾、滋阴止血，临床上用于治疗腰膝酸痛、月经量偏多及早年发白等肝肾阴虚症状[1]。研究证实对卵巢早衰性疾病的治疗有良好的效果[2]；自然衰老的女性或雌性动物中卵母细胞的线粒体含量降低或功能出现障碍[3]；有学者提出改善线粒体的功能结构或增加线粒体数量能延缓卵巢的衰老和改善女性生育能力的理论[4]，由此推演线粒体是卵巢衰老的决定因素[5]。已有研究报道二至丸能提高雌激素分泌、卵泡增加及闭锁卵泡减少等[6]。通过网络药理学研究发现二至丸可能与衰老相关的因子有关联，对肿瘤坏死因子(TNF)、缺氧诱导因子1(HIF1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)通路上多个位点进行干预，可以发挥延缓衰老的作用，调控老年大鼠炎症反应、缓解血液的黏度和改善免疫功能，共同发挥延缓衰老的作用[7]。

目前研究报道揭示二至丸通过刺激雌激素分泌改善卵巢的功能[8]，本研究将通过修复卵母细胞线粒体的功能验证卵母细胞的改善和衰老的延缓，为保护女性的生殖健康提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：选用雌性SD大鼠(3周龄)并具有正常动情周期，订购于上海维通利华实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0011。随机分组后饲养于上海中医药大学动物实验室，设置室内温度20～25 ℃、自然光照、噪音80分贝以下，自由进食饮水。该实验动物经上海中医药大学动物伦理委员会通过，伦理编号：2023-AR-004。

1.1.2 主要药物：二至丸组方：墨旱莲、女贞子各10 g，均订购于上海青山中药饮片公司。常规水煎液煎制并浓缩成浸膏，最后计算药液含总生药量为1 g/mL。

1.1.3 主要试剂：透明质酸酶(H3506)：美国 Sigma-Aldrich公司；ROS检测试剂盒(210812)：美国Thermo Fisher公司；ATP检测试剂盒(0180125)：美国 Life Technologies公司；hCG(20191226)：北京博士德生物；PMSG(20201316)：美国Sigma-Aldrich公司；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)抗体、视神经萎缩蛋白1(OPA1)抗体、PTEN诱导蛋白激酶1(PINK1)抗体、β-肌动蛋白抗体和HPR标记的山羊抗兔单抗(批号分别为GR142564、GR131331、GR121882、GR68023514、A20160112)：美国Santa Cruz公司；RIPA试剂(15687)：北京普利莱基因；BCA蛋白检测试剂盒(R0016)：北京联科生物；硝化纤维素膜(170-4156)：美国Bio-Rad公司；ECL显影液(RPN418)：美国Amersham公司。

1.1.4 主要仪器：分析天平(美国赛多利斯)；Smartplus-N30VF纯水仪；上海力康HF90型CO2培养箱；超净工作台(苏净安泰)；Mini Protean 3 Cell 型电泳槽；低温超速离心机(美国EPPENDORF公司)；蛋白电泳仪(美国赛默飞)；凝胶成像分析系统(美国伯乐公司)；EM-30AX电镜(美国库塞姆公司)；荧光显微镜(德国LEICA公司SP5-DMI6000-DIC)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药：根据周龄随机分组为青年组对照组(8周龄)、老年组对照组(20周龄)、二至丸高剂量组(3 g·kg-1·d-1)和低剂量组(1 g·kg-1·d-1)[9]，每组20只。青年对照组自然生长，不进行干预；二至丸高剂量组和低剂量组每日7-8点间采用灌胃的方式给药；老年对照组以同样的方式给予生理盐水，剂量30 mL·kg-1·d-1。每日1次，连续30 d。

1.2.2 收集大鼠卵母细胞：每组在灌胃干预结束后进行腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10 IU，2 d后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)15 IU促进排卵[10]，14～16 h后将SD大鼠以吸入乙醚的方式进行麻醉，70%酒精腹部消毒后，在无菌条件下切开腹部取SD大鼠卵巢组织，放置PBS液中，反复清洗3次，解剖显微镜下找到卵泡并用无菌注射针刺破，将卵母细胞游离出来，放置含有3 mg/mL透明质酸酶的DMEM液中，将透明质酸酶除去后获取卵细胞，放至DMEM培养基中。

1.2.3 测定ATP含量：采用生物发光检测试剂盒测定卵母细胞ATP含量，根据说明书进行操作。每组10个，单个置于96孔板不同孔中，用裂解液进行裂解，用微量测光仪迅速测定其产生的光量，绘制标准曲线，然后计算出卵母细胞的ATP含量。

1.3 电镜观察线粒体形态结构及数目 卵母细胞用3%戊二醛固定后置于4 ℃固定24 h，用预冷的PBS浸洗3 min×3次，再次加入3%戊二醛固定2 h，乙醇脱水，EMBed 812包埋固定。置电镜下观测并拍照，根据文献[10]计算得出细胞内线粒体数量。

1.4 活性氧(ROS)的测定 测定卵母细胞的ROS，把2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCHFDA)溶解于二甲基亚砜中制备的储备液中，置于-20 ℃的暗盒中保存。使用前1 h稀释至0.01 mmol·L-1，染色卵母细胞15 min。PBS充分浸洗5 min×3次，离心重悬后充分覆盖载玻片上，徕卡激光共聚焦显微镜下488 nm激发获得荧光，进行观察并拍照。

1.5 Western Blot测定PGC-1α、OPA1及PINK1蛋白的表达 将100个卵母细胞与300 μLRIPA裂解液混合，离心12 000×15 min，取上清，在95 ℃下变性10 min。然后蛋白进行电泳分离，将分离的多肽进行转膜，用2%BSA封闭1 h。TBS-T浸洗3 min×3次，分别加入一抗PGC-1α(1∶350)、OPA1(1∶350)、PINK1(1∶400)以及内参β-actin(1∶3 000)，4 ℃孵育过夜。过夜后TBS-T洗涤5 min×3次，加抗兔二抗(1∶5 000)室温下孵育1 h，TBS-T洗涤3 min×3次，用显影液对信号进行检测，灰度扫描，利用软件ImageJ计算OD值，分析数据。

2 结果

2.1 二至丸对各组细胞内ATP含量的影响 结果显示老年对照组ATP含量降低，与青年对照组对比有统计学差异(P<0.05)。证实随着年龄增加，卵巢内卵母细胞的能量合成是减少的。老年对照组经过二至丸的治疗，不论高剂量还是低剂量均提高了衰老细胞内的ATP含量(P<0.05)，证实二至丸可以提高卵母细胞合成ATP的能力。详见表1。

表1 二至丸对各组卵母细胞ATP含量的影响

2.2 二至丸对各组卵母细胞线粒体形态、数量的影响 从结果得知，老年对照组的线粒体：形态模糊辨认不清，特别是线粒体嵴，数目也减少(详见图1)，与青年对照组对比有统计学差异(P<0.05)，说明衰老的过程中线粒体的数目和质量都在随着下降。和老年对照组比较，二至丸高、低剂量治疗组线粒体数目均增高，形态结构改善。表明二至丸可以改善衰老卵母细胞线粒体的形态，使线粒体的数量增加。详见表2、图1。

注：A.青年对照组；B.老年对照组；C.二至丸低剂量组；D.二至丸高剂量组

表2 二至丸对各组细胞内线粒体数量的影响

2.3 二至丸对各组细胞内ROS的影响 由实验结果得知，老年对照组与青年对照组比较起来，细胞ROS增高(P<0.05)，这表明随着衰老线粒体产生ROS增多。二至丸用药组和老年对照组比较，高、低剂量组均可降低衰老卵母细胞的ROS产生(P<0.05)。这表明，二至丸可以减低老年大鼠线粒体内ROS的产生，改善线粒体的有氧氧化。详见图2、表3。

注：A.青年对照组；B.老年对照组；C.二至丸低剂量组；D.二至丸高剂量组

表3 二至丸对各组大鼠卵母细胞ROS的影响

2.4 二至丸对各组PGC-1α、OPA1和PINK1蛋白表达的影响 由实验结果可知，老年对照组和青年对照组相比，线粒体蛋白PGC-1α、OPA1及PINK1的表达量下降(P<0.05)，而这些蛋白都和线粒体的动力过程有关，说明线粒体的动力过程随着年龄的衰老而下降。与老年对照组比，二至丸低、高剂量组都提高了衰老细胞内的PGC-1α、OPA1和PINK1的蛋白表达(P<0.05)，说明二至丸可以改善衰老卵母细胞线粒体的动力过程。详见表4、图3。

注：A.青年对照组；B.老年对照组；C.二至丸低剂量组；D.二至丸高剂量组

表4 二至丸对各组细胞内PGC-1α、OPA1及PINK1蛋白表达的影响

3 讨论

从生理发育的角度证实卵泡的生长发育需要大量的能量，卵母细胞的发育需要经过形态和功能的改变，不断合成细胞内的各种物质，分泌激素等，都需要能量的供给，但能量的来源几乎全部来自于线粒体的有氧氧化。相比其他细胞，卵母细胞需要更多的能量以维持生理功能，导致能量代谢强度增大，线粒体易受损。一旦线粒体的功能出现障碍，细胞内能量就会减少，导致生理功能障碍，同时阐释了为什么女性生殖系统是最早表现出衰老的系统[11]。若改善线粒体的功能，如使用药物或通过微注射更换线粒体，可以逆转衰老的卵母细胞，延缓整个机体的衰老[12]，说明线粒体在衰老过程中是不可缺少的。

线粒体是一个细胞器，是动态的，是通过自我分裂不断生成新的线粒体，经过融合形成大的线粒体，再重新分裂成两个新的，将严重受损的线粒体进行自我吞噬、清除，整个过程可使线粒体的结构和功能得以保持完整，控制线粒体的质和量。但受PGC-1α调控，调控线粒体增生；OPA1位于线粒体内膜上，调控线粒体的融合；PINK1调控线粒体的自我吞噬，当线粒体受到损害时被激活，与E3泛素连接酶结合，激活自我吞噬，清除丧失功能的线粒体。上述三个蛋白的变化代表着线粒体动力功能的状态[13-14]。

本研究发现，老年大鼠卵母细胞线粒体数目少，形态发生改变，ATP含量减少，而ROS生成增多，线粒体动力过程相关蛋白下降，随着年龄的增长，机体能量代谢呈下降趋势，线粒体功能也随之下降。本研究结果与国内外的实验研究结果一致[15-16]，进一步印证线粒体功能下降是导致机体衰老的主要机制之一。通过PGC-1α、OPA1和PINK1的蛋白表达均明显下调[16-17]，分析在老年对照组中的卵母细胞有不同程度的下降，推测线粒体的动力过程出现某种程度的损害，导致新线粒体生成、融合、老化及受损的线粒体的清除都出现了障碍，一旦衰老的卵母细胞内线粒体的含量减少，形态也随之发生变化[17]。

二至丸来源于明代吴旻辑的《扶寿精方》，在《医便》中的二至丸即是女贞丹。根据冬至之时采取女贞子和夏至之日收割墨旱莲由来，制成丸药，故称为二至丸。女贞子性平，味甘苦，偏凉，入肝肾之经，有补益肝肾、滋阴补血和清肝明目作用；墨旱莲性凉且甘酸，具备凉血止血、养阴乌发和祛湿止痒的功效。女贞子与墨旱莲性平和，两者配伍，相须为用，补肝肾之经，治肝肾阴虚所致耳鸣、头晕、目昏和崩漏等[18]。二至丸经过药理分析得知其药理成分，研究得知其成份槲皮素、木犀草素、刺槐素和山奈酚有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集及保护神经等多种作用[19]；证实槲皮素又是一种黄酮类化衍生物，在卵巢早衰小鼠的卵泡生长至成熟的过程中有增加免疫的功效，抵抗由免疫低下引起的卵巢炎症，同时促进卵泡的生长发育至成熟并排卵[20-21]，研究证实减少卵巢颗粒细胞的凋亡是因木犀草素抑制TNF-α和IL-6的作用[22-23]。促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇是由于女贞子中的β-谷甾醇在发挥作用，属于植物性甾醇[24]。通过本次实验发现，二至丸高低剂量均能够改善衰老卵母细胞的线粒体数量和质量，增强ATP合成能力，减少ROS的产生，从而提高线粒体的功能。二至丸改善卵母细胞线粒体功能是通过上调PGC-1α、OPA1和PINK1蛋白的表达，证实二至丸调控线粒体的动力过程，加速其新陈代谢。

综上所述，二至丸可以促进衰老卵母细胞内线粒体的有氧氧化，促进ATP的产生，促进线粒体调控蛋白的表达，改善线粒体的新陈代谢，为二至丸治疗和改善女性卵巢早衰和卵巢老化提供新的治疗思路及分子生物的机制。