动物生物安全实验室废弃物分类高压灭菌程序探索

曾荟燕，王团结，李婉清，李 强，孟伯龙，郭桐同，李倩琳，杨成岗，门星光，张广川

（中国兽医药品监察所，北京 100081）

2021 年实施的《中华人民共和国生物安全法》对病原微生物实验室生物安全提出了明确要求，指出病原微生物实验室应当加强对实验活动废弃物的管理，依法对废水、废气以及其他废弃物进行处置，采取措施防止污染[1]。《病原微生物实验室生物安全管理条例》亦提出实验室应当依照环境保护的有关法律、行政法规和国务院有关部门的规定，对废水、废气以及其他废弃物进行处置，并制定相应环境保护措施，防止环境污染[2]。由此可见，对实验室废弃物的有效灭菌处理，是实验室生物安全的重要组成部分。

根据实验室被处理对象的生物危害程度和采取的防护措施，生物安全实验室分为微生物生物安全实验室（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4）和动物生物安全实验室（ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4）[3]。根据实验室种类不同，实验活动产生的废弃物种类亦有差异。微生物生物安全实验室产生的废弃物主要为试验耗材（如吸管、细胞培养瓶、镊子、离心管等）和个人防护用品，动物生物安全实验室产生的废弃物主要为动物尸体、动物排泄物、个人防护用品及试验耗材。

高压灭菌是通过破坏或灭活生物因子对试验材料灭菌和废弃物去污染的最有效和可靠的方法，不同类型的废弃物通常需要不同的操作周期以达到适当的灭活温度[4]。考虑到动物生物安全实验室废弃物种类多，且灭菌时装载量较大，需要对废弃物的灭菌效果进行验证，以确保实验室生物安全。本研究通过对中国兽医药品监察所动物生物安全实验室产生的废弃物进行分类，探索了不同种类废弃物合理的高压灭菌程序，以期为动物生物安全实验室废弃物处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

生物安全型脉动真空灭菌器（ 型号BIST-P3）、化学指示卡（批号22809）、生物指示剂（批号22F02），均购自山东新华医疗器械股份有限公司；隔水式恒温培养箱（型号GNP-9270），购自上海精宏实验设备有限公司；鸡、鸭、兔、鼠等小动物尸体，猪、牛、羊等大动物尸体，粪膜所收集的禽类粪便，猪、牛、羊、兔等饲养动物的袋装粪便，以及防护服、利器盒、过期饲料和废弃垫料等一般废弃物，均来自中国兽医药品监察所ABSL-1 和ABLS-2 实验室；高压灭菌袋（规格870 mm×760 mm），购自长沙湘安环保科技有限公司；不锈钢高压灭菌箱（规格尺寸50 cm×40 cm×30 cm，箱体两侧带有透气孔），购自北京宇轩宏达科技有限公司。

1.2 废弃物分类及高压前预处理

根据中国兽医药品监察所动物试验活动产生的废弃物种类，将废弃物分为5 类：小动物尸体（鸡、鸭、鼠、兔等）、大动物尸体（猪、牛、羊等）、禽类粪便以及猪、牛、羊等动物的袋装粪便和一般废弃物（防护服、利器盒、过期饲料和垫料等）。

小动物尸体处理，是将小动物腹部剖开并装入高压灭菌袋中；大动物尸体处理，是将动物的头及四肢肢解，并将胸腔和腹腔剖开后放入高压灭菌袋中；禽类粪便，由铺设在隔离器底部的粪膜卷轴旋转收集；一般废弃物，是将防护服、利器盒、过期饲料和废弃垫料等物品置于高压灭菌袋中。以上物品的高压灭菌袋置于灭菌箱后体积不可超过灭菌箱的2/3。袋装粪便是猪、牛、羊、兔等动物粪便，可直接收集到高压灭菌袋中。高压前将灭菌袋中的粪便平铺在灭菌箱中，平铺高度不超过10 cm。所有装有废弃物的高压灭菌袋袋口用专用胶带适度包扎，不要过紧[5]。

基于实验室废弃物处理流程，在试验活动中产生的动物尸体、粪便及垫料无法被实时高压灭菌处理时，需暂存于冷库[6]。高压前先对此类废弃物进行解冻。废弃物解冻是在灭菌前将废弃物置于脉动真空灭菌器中，通过流经锅体夹套中的蒸汽进行解冻，4 h 后再对其进行高压灭菌处理。

所有废弃物高压灭菌验证均在灭菌器满载的情况下进行[7]。灭菌器置物架上、下两层各放置11 箱高压灭菌箱，22 个灭菌箱之间保留适当空隙，确保蒸汽能够顺利穿透。

1.3 生物指示剂和化学指示卡放置方法

小动物尸体的化学指示卡和生物指示剂放置于尸体的腹腔内部，大动物尸体的放置于尸体肌肉里层，禽类粪便的放置于粪膜卷轴中心位置，猪、牛、羊等动物袋装粪便的放置于粪便底层，一般废弃物的放置于每个灭菌箱内废弃物的中心位置[8]。

1.4 灭菌器程序设定

将灭菌器预设程序中的灭菌温度121 ℃、排空上限80 kPa、脉动次数4 次设置为固定参数。根据灭菌器使用说明，初始以30 min 作为1 个灭菌时间单位，每间隔30 min 设置1 个灭菌时长进行灭菌验证；将小动物尸体、禽类粪便、一般废弃物的排空下限设置为-80 kPa。因袋装粪便与大动物尸体含有液体成分较多，排空下限不宜太低，设置为-10 kPa。

1.5 结果判定

高压灭菌结束后，取出生物指示剂和化学指示卡。观察化学指示卡变色情况，若达到标准色或深于标准色，则灭菌合格；若颜色浅于标准色，则灭菌失败。采用专用夹具，夹破生物指示剂的内含培养基，将生物指示剂置于隔水式恒温培养箱，同时设置阴性和阳性对照，56 ℃培养48 h。当阴阳性对照成立时，若培养液保持紫色，则灭菌合格；若培养液变成黄色，则灭菌失败。只有生物指示剂和化学指示卡均指示合格时，才表示灭菌合格。

2 结果

2.1 小动物尸体

结果（表1）显示，当灭菌时间为30 min 时，22 箱被灭菌物品中，14 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果为合格，8 箱为不合格。当灭菌时间为60、90 min 时，22 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂灭菌结果均为合格。

表1 小动物尸体灭菌结果

2.2 大动物尸体

结果（表2）显示，当灭菌时间为30 min 时，有5 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果为合格，17 箱为不合格；当灭菌时间为60 min 时，13箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果为合格，9 箱为不合格；当灭菌时间为90 min 时，22 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格。

表2 猪、牛、羊等大动物尸体灭菌结果

2.3 禽类粪便

结果（表3）显示，当灭菌时间为30 min 时，22 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为不合格；当灭菌时间为60 min 时，11 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果为合格，11 箱为不合格；当灭菌时间为90 min 时，16 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果为合格，6 箱为不合格。因90 min 未达到灭菌效果，将灭菌时间延长至120 min。当灭菌时间为120 min 时，22 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格。

表3 禽类粪便灭菌结果

2.4 袋装粪便

结果（表4）显示，当灭菌时间为30 min 时，7 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格，15 箱为不合格；当灭菌时间为60 min 时，18箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格，4 箱为不合格；当灭菌时间为90 min 时，22 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格。

表4 猪、牛、羊等动物袋装粪便灭菌结果

2.5 一般废弃物

结果（表5）显示，当灭菌时间分别为30、60、90 min 时，22 箱废弃物的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格。

表5 一般废弃物灭菌结果

2.6 废弃物灭菌程序确定

分别选取5 种废弃物首次通过灭菌试验的灭菌参数进行3 次重复试验，发现重复试验的化学指示卡和生物指示剂结果均为合格，因此确定5 种废弃物的灭菌参数如表6 所示。

表6 废弃物灭菌参数

3 讨论

3.1 高压灭菌温度和时间的重要性

采用灭菌器预设程序对动物尸体和动物粪便进行高压灭菌时，有部分化学指示卡和生物指示剂结果为灭菌失败。在后续试验中，通过对灭菌程序的灭菌时间、脉动下限等参数优化处理，实现了废弃物的可靠灭菌。

影响高压灭菌效果的因素有很多，比如温度、时间、脉动方式、灭菌包质量、灭菌器是否漏气等[9-12]。一个灭菌程序对微生物的致死效应主要由两大因素决定，即温度和时间[13]。只要被灭菌对象的中心温度达到设定温度，维持一定时间就可实现灭菌。而其他影响因素是为热蒸汽能够快速穿透物品提供便利。例如有研究[14]表明，排空方式为上限80 kPa、下限-80 kPa 比上限80 kPa、下限0 kPa 具有更彻底的冷空气排除效果，进而为饱和蒸汽的快速、充分渗入提供了条件。工作中，需要根据实验室实际情况综合考虑饲养动物的便利性和废弃物的无害化处理，如采用卷粪膜的方式收集禽类粪便可以提高工作效率，但因粪便被多层塑料膜包裹，其中心部位需要很长时间才能达到灭菌温度，因此需通过延长灭菌时间（120 min）实现灭菌效果。同时，对于开展高致病性病原微生物试验活动产生的废弃物，需采用多层包装和袋口扎紧等措施保障生物安全，在高压灭菌时可通过调整脉动次数和延长灭菌时间等方式实现可靠灭菌。

3.2 废弃物分类高压的重要性

动物生物安全实验室的废弃物种类较多，涉及动物尸体、动物排泄物、动物垫料、防护用品以及试验耗材等。目前国内尚缺乏动物生物安全实验室废弃物的消毒技术规范，灭菌器的说明书也仅是提供预设程序。高压蒸汽灭菌器作为废弃物无害化处理的有效方式，必须对其进行规范管理，根据实验室器械、感染性废弃物、动物尸体等不同的消毒灭菌对象，建立各项规章制度和操作规程[15]。因此，动物生物安全实验室应根据废弃物种类进行分类高压，保证灭菌效果。除确保实验室生物安全外，分类高压还能优化实验室废弃物处置程序，提高实验室废弃物无害化处理效率。

3.3 废弃物高压验证的重要性

废弃物去污染处理后，必须定期对消毒灭菌效果进行验证。验证措施包括物理验证和微生物验证，同时压力蒸汽灭菌器有多种灭菌程序，也应对每一种程序分别验证[7，16]。动物生物安全实验室在进行废弃物灭菌前，应根据实验室灭菌设备体积大小、废弃物种类及废弃物包装大小，开展高压灭菌验证。然后根据灭菌结果，制定本单位废弃物高压灭菌标准操作规程，并对废弃物的灭菌程序、废弃物包装尺寸、废弃物类别、灭菌时袋口状态等作出明确规定。对采用相同高压程序实现废弃物灭菌的，在实际工作中可一同高压，否则应分类、分次进行高压。

3.4 加强动物生物安全实验室消毒技术规范建设

我国于2002 年发布的《消毒技术规范》[17]对医疗卫生机构废弃物处理作了明确要求，但涉及动物生物安全实验室及微生物生物安全实验室废弃物处理时，尚属欠缺。通常情况下，后者参考《消毒技术规范》开展相关工作。生物安全是国家安全的重要组成部分，因此建议加强各级动物生物安全试验室消毒技术规范建设，确保实验室废弃物无害化处理，保障生物安全。