分子动力学模拟在医学微生物实验教学中的应用

苗小康,谢俊秋,杨雯乐,窦建琳,韩 俭

(1兰州大学基础医学院实验教学中心, 兰州 730000; 2兰州大学基础医学院病原生物学教研室)

科学技术尤其生命科学领域不断变革发展,以及人民群众对更高水平的医疗卫生服务的需求,对医学学科的发展提出了新的要求,因此新医科应运而生。国务院办公厅关于加快医学教育创新发展的指导意见明确指出,推进“医学+X”多学科背景的复合型创新拔尖人才培养,培养高层次拔尖创新医学人才[1]。创新性医学人才的培养是多方位的,基础知识、基本技能的融会贯通是其中重要的一面。按照库恩的观念,创新也需以学科范式为基础,是对旧范式的超越和突破,基础是创新的根本[2]。医学微生物实验是一门理论结合实践的课程,是医学生必修的医学基础课程。医学微生物实验课程对医学生的教育更具有显然的重要意义。要学好这门课程,从基本概念、原理着手是必然之道。本文将基于化学和计算机学科的分子动力学模拟技术引入医学微生物实验,以帮助学生提高对热力灭菌实验基本原理的理解,以期抛砖引玉。

热力灭菌在医学微生物实验教学中是重要基础内容,作为最常用的灭菌方法,其在几乎所有涉及微生物的实验中都发挥了基础性作用。各种实验器材、培养基的热力灭菌是微生物实验的常规及必须程序,是实现无菌操作的重要手段。利用热力灭菌灭废微生物培养物及其他感染性材料是保障生物安全的最重要措施之一。此外,热力灭菌的理论中涉及微生物的结构及生理等基础知识,因此,学习热力灭菌也是对医学微生物前期基础知识的一次有效回顾和应用。综上,有必要重视热力灭菌的实验教学。

热力灭菌主要利用高温对微生物菌体组成物质的结构破坏从而使其生理功能丧失,进而导致微生物死亡达到灭菌效果[3,4]。在实验教学中,教师可以通过灭菌前后的效果对比使学生对热力灭菌有直观感受。而更深入的灭菌机制都发生在微观层面,但是这些微观层面的现象无法直观地呈现给学生。这就阻碍了学生从微观到宏观的思维过程,不利于知识的全面掌握及应用。

分子动力学模拟技术利用计算机软硬件,在分子层面模拟真实世界中不易观察的现象。这些技术对多个学科的研究产生了重要影响。随着技术及硬件条件的提高,分子动力学模拟技术正在被越来越多地应用于教学中[5]。热力灭菌在微观机理层面发生的变化主要是蛋白、核酸等生物活性物质在高温下变性失活,而这些变化过程可以利用分子动力学模拟技术得以实现。本文介绍利用分子动力学模拟技术获得这些微观变化过程及其在热力灭菌教学中的应用。

1 模拟研究

1.1 模拟思路

热力灭菌破坏微生物的结构并使蛋白、核酸等生物大分子变性。因此,本文选取微生物的蛋白、脱氧核糖核酸(DNA)以及细胞膜模型作为模拟对象,分别模拟它们在高温水环境中的变化过程。选取变化过程中的特征结构作为热力灭菌微观机制的直观展示。

1.2 模拟方法

分子动力学模拟的软件多种多样。本文使用开源免费的GROMACS软件包进行分子模拟,模拟结果的分析也使用GROMACS包中自带的分析工具[6]。

1.2.1 蛋白质模拟 为了与教学更贴切的同时考虑模拟时长,本文选择大肠埃希菌(E.coli)的肽脱甲酰基酶(Peptide deformylase,PDB ID:2W3T)作为代表蛋白质进行模拟。2W3T结构中包含167个氨基酸残基,约2 700原子。获得的PDB结构文件只保留蛋白残基部分。为了保障变性后蛋白不与自身镜像发生相互作用,将处理过的蛋白结构溶在边长15 nm的立方水盒子中,导致总原子数有36万之多。之后用钠离子中和蛋白携带的负电荷,使整个系统保持电中性。经过两次梯度下降法,使体系收敛于原子最大受力小于1 000,再进行100 ps的NVT系综平衡(限制蛋白中原子运动)。模拟温度为1 000 K,热浴使用V-rescale,并根据麦克斯韦分布产生初速度。长程静电作用利用PME方法,短程静电和范德华力的截断值设为1 nm。最后以平衡后的最终结构为起始结构,以1 fs步长进行1 ns的模拟,模拟参数与平衡时一致。

1.2.2 核酸模拟 核酸的模拟选择了人心杆菌(Cardiobacteriumhominis)的一段18碱基对的DNA片段(PDBID:6ROS)。DNA片段溶于由21 154个水分子和34个钠离子构成的边长8.5 nm的立方盒子中。利用梯度下降法使体系中原子最大受力小于100,以达到能量最小化目的。之后利用同蛋白质模拟相同参数对核酸进行100 ps平衡及1 ns模拟,除在热浴中对DNA和溶液分组控温。

1.2.3 细胞膜模拟 本文利用CHARMM-GUI网络服务构建了包含96个1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(POPE)、108个钠离子、12个氯离子及5 149个水分子的革兰阳性细菌质膜模型[7]。首先,按照CHARMM-GUI给出的分步模拟参数,对细胞膜进行能量最小化和平衡模拟。由于网站给出的平衡模拟时间太短,本文以前步最后模拟结构为起始,继续平衡模拟300 ns,得到了在常温常压下充分平衡的细胞膜结构。其次,将常温常压下的平衡结构置于1 000 K的NVT系综中进行1 ns的高温模拟,体系热浴为berendsen并且分为膜和溶液两组分别控温,其他模拟参数同蛋白质的模拟。

1.3 模拟结果

1.3.1 蛋白质模拟结果 分子动力学模拟是将体系中的原子作为一个个质点,依据牛顿力学求算不同时刻这些原子的位置得到体系随时间变化的动力学信息。我们将模拟过程中不同时刻的各个原子位置与其初始状态的位置进行比较,可以评价不同时刻体系的变化程度。这种原子位置变化的比较通常用RMSD值来表征,当RMSD值的变化不再剧烈波动时说明模拟体系到达了某个阶段的稳定态也即动力学模拟较为充分[8]。如图1A所示对肽脱甲酰基酶的模拟可以用作动力学分析。肽脱甲酰基酶的正常三级结构中含有α螺旋、beta折叠及loop等二级结构,整体呈球状(如图1B中0 ps所示)。回旋半径是一个表征模拟体系紧实程度的物理量,半径越小说明致密性越好即蛋白质结构就越稳定。从图1C中可以看出在模拟的初始阶段蛋白结构有较明显的松弛的趋势;模拟后期,尽管结构还在变化,但是其回旋半径绕均值波动。蛋白质的变性在微观层面还体现在蛋白质二级和三级的剧烈变化以致于失去了稳定状态下的正常结构,包括螺旋结构的解螺旋、beta折叠中片层的解离等。图1C中的代表性结构摘选自肽脱甲酰基酶的模拟轨迹,随着时间的延长,可以观察到蛋白质结构中各种二级结构逐渐消失,整体结构也较初始结构有了明显的膨大。这样的结构已经与正常结构发生很大的偏差,其正常功能也将随之丧失。

图1 高温下蛋白质模拟结果

1.3.2 脱氧核酸模拟结果 高温可以使得核酸变性,从而达到杀灭细菌的作用。脱氧核酸的变性指核酸双螺旋链上碱基之间的氢键断裂,碱基间的堆积力遭到破坏,进一步双链解离。DNA正常的结构发生变化后,细菌的正常生理功能即被破坏,细菌死亡[9]。图2所示为一段正常结构的DNA在高温下发生变性、双链解离的过程。伴随多数碱基间氢键的断裂,双螺旋结构很快就发生了扭曲,在不到1ns的模拟时间内双链完全解离。

图2 高温下DNA模拟结果

1.3.3 细胞膜模拟结果 细胞膜的主要成分是各种磷脂分子,不同类型的细菌含有的磷脂种类和数量不尽相同,但磷脂分子会随着温度的升高而运动增强的特性却是一致的。本文以常用的革兰阳性菌的模式细胞膜为对象研究高温对其影响。生理条件下细胞膜的运动在一定范围内,因此维持细胞形态,并为细胞提供了与外界隔绝的屏障。正常情况下水分子主要通过水通道蛋白进出细胞[10],当细胞膜运动增强结构发生变化,水分子就会直接通过细胞膜进出细胞,大量的水分子自由进出细胞将导致细胞失去正常的渗透压而死亡。本文的模拟结果表明,在高温下,随着模拟时间的延长,细胞膜中的水分子数量增加,同时细胞膜的厚度也有所变化。这些结果都表明高温对细胞膜正常结构的破坏作用(图3,黑色箭头所示为膜中水分子)。

图3 高温下细胞膜模拟结果

2 模拟结果教学应用

细菌正常生理需要大量的酶参与。肽脱甲酰基酶是一种金属蛋白酶,广泛存在于细菌体内。在细菌合成蛋白的过程中可以脱除甲硫氨酸上的甲酰基,从而使细菌能够合成出功能化的蛋白质。脱除甲酰基的过程是细菌合成蛋白的必须过程[11]。当肽脱甲酰基酶的结构发生重大变化后其功能会丧失进而导致细菌不能合成所需蛋白质而死亡。课堂讲授时,教师很难对蛋白结构的变化有具体的描述,而高温模拟结构变化的展示则可以使学生更直接地观察到高温灭菌时蛋白质变性的具体景象;结合这一蛋白的功能和结构变化将使学生对高温灭菌的原理拥有深刻理解。

核酸也是生命的基本物质,其发挥功能也要基于正常的结构。本文所选核酸为细菌中一段CG含量较高的片段,CG含量高的核酸双链结合力更强[12],需要更剧烈的作用才能使其破坏。教学过程中通过本文所示的高温下核酸双链解离过程,结合核酸的复制、转录等机制引导学生体会非正常结构核酸导致的功能紊乱,从而直观体会高温对核酸较强的变性作用,进而加深对高温灭菌原理的印象。

细胞膜作为细胞的基本组成部分是细胞正常生理的基本保障,但在细菌的高温灭菌中较少提及。本文所示细胞膜中水分子的变化过程间接反映了其结构的稳定性变化,结合细胞膜正常生理功能,可以拓展学生对高温灭菌中细胞的多方面变化的理解。此外,通过分子模拟得到上述结构变化过程的轨迹信息,将轨迹信息转变为动画演示使学生了解到高温灭菌的动态过程。这将极大地增加课堂的吸引力,从而提升教学效果。

医学微生物实验作为医学生的基础课程之一,对培养医学生认识掌握感染性疾病基础具有重要的支撑作用[13]。医学生掌握扎实的医学微生物知识是其培养训练过程的必须要求。医学知识内容庞杂,学生任务繁重,因此使用更多的新颖性、交叉融合性的教学手段对增强学生学习兴趣,提高学习效率将会起到事半功倍的效果。

在医学教育迈入高质量发展的新时代,国家对医学教育提出了系统的指导意见,其中医学教育创新是基本原则之一。创新教育教学方法是医学教育创新的重要方面,对提高医学人才培养质量具有直接作用。教学方法创新形式丰富多样,而内涵则在于提高学生对知识的理解运用能力。教学方法的创新在一定程度上依赖于交叉学科的发展,当相关学科的技术发展能够被较为便捷地应用于目标学科时,应适时地改革创新教学方法从而提高学生掌握知识的能力。本文将能表现出微观过程的分子动力学模拟应用于实验教学中,期望这种教学方式能为更多教学创新的产生提供经验。