干旱-复水对桂西北喀斯特地区青冈栎幼苗叶片光合能力、叶绿素荧光和显微结构的影响

邓 平 ,吴 敏* ,林 丁 ,赵 英 ,陆海娇 ,岑 英

(1 玉林师范学院 广西农产资源化学与生物技术重点实验室 广西高校亚热带生物资源保护与利用重点实验室,广西玉林 537000;2 中南林业科技大学 林学院,长沙 410004)

喀斯特(岩溶)地质在中国分布广、面积大,约占全国国土面积的1/7,是中国四大生态环境脆弱区之一,而广西桂西北喀斯特地区岩石裸露面积达8.95万km2,是中国乃至世界亚热带岩溶典型区[1]。桂西北喀斯特地区为亚热带季风性湿润气候区,存在土层浅薄,基岩裸露,大气降水入渗系数大,漏失严重,形成下雨涝害、天晴干旱的季节性干旱特征[1-2]。由于降水的急剧渗漏形成干湿频繁交替,造成该地区植物需短时间能对干旱-复水做出形态结构和生理变化响应;但目前对该地区植物的研究多集中在其旱期的耐旱策略和机制方面,忽略了其旱后恢复力和适应性的研究,而这不仅是评价该地区植物耐旱性的重要指标[3-4],也是影响该地区植被恢复与造林成败的关键因素。

在干旱环境下,植物的光合能力反映植物生长受抑制的程度,也可以衡量植物受干旱环境胁迫影响的差异性[5]。叶绿素荧光技术是研究植物光合作用的内在探针,通过研究叶绿素荧光参数的变化过程,能快速、精准、无伤害地反映植物对光能的吸收和利用状况,进一步了解干旱胁迫对植物光合作用影响的程度[6]。此外,叶片的细胞结构也会直接或间接影响植物光合作用,在干旱环境下,气孔、表皮厚度及其覆盖物能减少蒸腾,而叶肉作为进行光合作用的主要部位,其栅栏组织和海绵组织厚度变化会直接影响叶片的光合效率[7]。研究表明,在轻度或短期干旱环境下,一些植物叶片气孔密度增大,有利于短时间内充分利用有效水分进行光合作用,同时气孔密度大也有助于光合作用和散热;另一些植物则降低气孔密度、关闭气孔、减小蒸腾作用,进而影响植物光合作用中光能电子传递和转换、光合磷酸化及暗反应等一系列过程[8]。但随着干旱程度加剧或时间的延长,植物叶肉细胞膜损伤、光合酶活性受干扰,使植物光合速率显著下降,光系统Ⅱ(PSⅡ)受到不可逆破坏和损伤,造成植物生长发育受抑制甚至死亡[9-10]。在旱后复水恢复过程中,植物能否迅速弥补干旱胁迫造成的损伤快速恢复,是其对干旱环境适应性的重要表现[11]。研究表明,旱后复水能够使植物的生理功能得到恢复,可在一定程度上弥补干旱对植物造成的伤害。其中,耐旱性强的植物旱后复水恢复快,其水分状况能够在24 h内得到恢复,提高植物光合速率并使其生长加速;但干旱后复水对植物生长上的补偿通常是有限的,其生长的恢复程度可能与复水前干旱的胁迫程度和持续时间有关[12-13]。因此,同时进行不同强度干旱胁迫及其旱后复水处理,考察植物光合参数、叶绿素荧光参数以及叶片解剖结构变化的特征,才能够较为全面地了解植物对干旱环境适应机制,科学评价其耐旱性。

青冈栎(Cyclobalanopsis glauca)为壳斗科青冈属常绿阔叶树种,是喀斯特地区常绿落叶阔叶混交林常见树种之一,对喀斯特生境具有较强的适应性,是亚热带喀斯特石漠化地区进行造林或植被恢复时选用的主要树种之一[14]。野外调查发现,喀斯特地区的青冈栎天然林和人工林虽结实量大,但由于生境土层浅薄、基岩裸露、干旱以及暂时性水湿环境交替,导致种子萌发率低,幼苗定居困难,影响种群自然更新。迄今,关于喀斯特干旱胁迫环境下青冈栎研究主要集中于苗期的生长、水分参数、抗氧化酶活性、叶绿素含量、荧光及光合参数等生理特性方面[15-18],忽略了对其旱后恢复能力的研究,而这却是深入了解其对喀斯特干湿交替生境适应机制的关键内容。因此,本研究通过盆栽控水试验模拟喀斯特野外干湿条件,测定分析不同强度干旱胁迫及其复水后青冈栎幼苗叶片的光合生理、叶绿素荧光特性及叶片形态解剖结构的变化规律,探讨青冈栎幼苗对土壤水分变化的反应和适应机制,为这一地区的植被恢复和人工造林提供基础理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2016年11月中旬,自桂林喀斯特地貌雁山区大埠乡甘棠村后山、阳朔县葡萄镇轭头、白沙镇富里湾和高田镇白沟、碑头“风水山”的青冈栎天然林(24°40′-25°40′N,110°9′-110°42′E)采集青冈栎种子,在实验室选出健康饱满大小相似的种子阴干后,在4℃低温沙藏备用。

整个试验在广西玉林师范学院玻璃温室大棚中(22°64′N,110°14′E)进行,昼夜温度分别为28℃和20℃,白天光强为600～800μmol/(m2·s),相对湿度保持在(70±3.5)%。2017年3 月初,将青冈栎播种于黑色育苗袋中(高21 cm,直径21 cm),播种土由泥炭土和珍珠岩按照1∶1体积比(V∶V)混合而成,每袋播种5粒种子,共30盆。待青冈栎幼苗出现2～3片真叶,平均株高为10 cm 时,移栽到塑料桶中(高44 cm、上下内口径分别为35 cm 和30 cm),每桶2株,共40桶。为了模拟采种地喀斯特土层结构,塑料桶中的土壤分别装入岩石层和混合土层。其中,下层为岩石层即碎石层(厚18 cm,重9.5 kg);上层为混合土层包括采种地收集的棕色石灰土、河床细沙、腐殖质,按照1∶1∶1比例(V∶V∶V)混合,且田间最大持水量为28.6%,p H 值为7.42,土壤有机质、全氮、全磷和全钾含量分别为43.89,2.23,0.72,8.97 g/kg,经过烘干(80℃)到恒重,每桶均装入等量的混合土15.4 kg。为保证幼苗健康生长,育苗与缓苗期的土壤含水率维持在23.4%。

1.2 试验设计

WP4-T 露点水势仪(Decagon Devices,Inc.,Hopkins,USA)实测结果表明,野外青冈栎采种地0-20 cm 土壤水势为(-0.1)(在雨季降雨后土壤水势)～(-1.5)MPa(在旱季萎蔫点土壤水势),再依据青冈栎种子干旱胁迫萌发实验结果[19],将本试验干旱胁迫土壤水势范围设定为4个梯度:-0.1 MPa(对照,CK)、-0.5 MPa(轻度干旱,LD)、-0.9 MPa(中度干旱,MD)和-1.5 MPa(重度干旱,SD)。

在干旱胁迫处理前,使用WP4-T露点水势仪测定试验土壤样品的水势,并通过烘干称重法测定相应的土壤含水量;然后,建立试验土壤水势与含水量的回归关系,绘制土壤水分特征曲线;最后,根据该曲线,计算出土壤水势为-0.1,-0.5,-0.9,-1.5 MPa时的土壤含水量分别为23.4%、19.3%、15.2%和11.1%,并在干旱-复水试验期通过称重法控制干旱梯度[20]。

2017年6月15日,待幼苗生长至7～8片叶,株高达(15.90±1.13)cm 时,开始停止浇水10 d左右,待各桶土壤水分通过蒸发下降至预设的4个水分梯度,开始干旱胁迫试验。整个干旱处理试验持续60 d,复水处理7 d(使其土壤含水量达到23.4%);每个处理10桶(共20株),并随机将其分成2组,其中5桶(共10株)用于复水试验。每盆隔天18:00称重,将损失的水分重新补充到土壤中使其达到相应的干旱梯度(称重控制干旱与复水梯度时,忽略幼苗重量)。在第60天和第67天分别对各处理下青冈栎叶片水分状况、光合气体交换参数、叶绿素荧光参数和叶片解剖结构指标进行观测。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 光合气体交换参数

测定于9:00—12:00进行,随机选取每个处理每盆青冈栎幼苗中上部3枚成熟叶片,即每个处理共计15 枚叶片(15 个重复),使用便携式光合仪(3051D,中国浙江托普云农科技股份有限公司)测定叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和田间CO2浓度(Ca),并计算植株叶片气孔限制值(L s=1-Ci/Ca)和瞬时水分利用(WUE=Pn/Tr)[21]。测定系统采用开放式气路,自然光源,光合有效辐射为600～800μmol/(m2·s),室内CO2浓度为370～480μL/L,空气相对湿度为65%～73%,叶片温度控制为21～23℃[16]。

1.3.2 叶绿素荧光参数

选取测定光合气体交换参数时的相同叶片,每处理15 个重复,采用美国OPTI-SCIENCES OS-30p+快速植物胁迫测量仪测定,叶片暗适应30 min后,再照射饱和脉冲光[12 000μmol/(m2·s)],直接从系统获得初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、可变荧光(Fv)、最大光化学效率(Fv/Fm)以及潜在光化学效率(Fv/Fo)。

1.3.3 叶片相对含水率和水势

采集每个处理完成光合和荧光参数测定的6枚叶片,分别用于叶片相对含水率与叶片水势的测定,各指标每处理3次重复。其中,叶片相对含水率测定时,首先测定叶片鲜质量,然后将叶片浸泡在纯净水中24 h测定饱和鲜质量,最后放置在烘箱中于70℃下烘烤48 h后测定叶片干质量;据此计算叶片相对含水率[(叶片鲜质量-叶片干质量)/(叶片饱和鲜质量-叶片干质量)×100%][22]。叶片水势测定使用压力室法(1505D-EXP,PMS Instrument Company,Albany,USA)。

1.3.4 叶片光学解剖结构观测

次日上午10:00迅速从测定完水分状况后剩余的,且测定过光合、叶绿素荧光的叶片中每个梯度各取6枚叶片分别用于气孔和叶片解剖结构观测,各指标(气孔和叶片解剖结构)每处理各3 枚叶片(3次重复)。(1)气孔形态观察:叶片气孔取样先用脱脂棉蘸酒精轻轻擦拭干净其表皮灰尘,用无色透明指甲油印迹法取上下叶片表皮中部的气孔;待指甲油晾干后,采集面积10 mm×15 mm 的气孔印迹样品制成临时装片,制好的装片用数码光学显微镜(Lecia DM2500)观测拍照记录气孔形态特征。(2)气孔密度观测:每个处理各制9个临时装片于数码光学显微镜下拍照观测;每个装片随机选择3个不同的视野拍摄图像保存,每个处理共计27 张图片[23];最后使用图形分析软件Image-J分别测量计算气孔密度。(3)叶片解剖结构观测:每个处理3枚叶片清洗后沿主脉横切,切块约5 cm×5 cm 后用FAA 固定,乙醇和二甲苯系列脱水,石蜡包埋,番红-固绿染色,中性树胶封片;切片在数码光学显微镜(Lecia DM2500)下观测并拍照,通过图形分析软件Image-J测量叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、主叶脉厚度和导管直径,并计算栅海比(栅栏组织组织/海绵组织厚度);每个处理收集取30个图片测定统计各指标参数。

1.4 数据处理

利用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比较检验不同强度干旱胁迫间和复水后不同干旱胁迫间各指标差异显著性(α=0.05);采用独立样本t检验分析在相同干旱胁迫强度下复水前后各指标的差异显著性(α=0.05)。利用Origin 9.0软件绘图。图表中数据表示为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 干旱复水对青冈栎幼苗叶片相对含水率和水势的影响

图1显示,随干旱胁迫加剧,青冈栎幼苗叶片相对含水率和水势均大幅度显著下降(P<0.05);其中,轻度、中度和重度胁迫下叶片相对含水率分别比对照显著减少了13.52%、23.59%和40.38%,叶片水势则分别比对照显著降低了118.25%、290.62%和411.64%。

CK.对照(-0.1 MPa);LD.轻度干旱(-0.5 MPa);MD.中度干旱(-0.9 MPa);SD.重度干旱(-1.5 MPa);不同小写字母表示复水前或者复水后各干旱胁迫处理间差异显著(P<0.05);*和**分别表示相同干旱胁迫强度下复水前后差异显著(P<0.05)和差异极显著(P<0.01),ns表示无显著差异(P>0.05)。下同。图1 干旱胁迫和复水后青冈栎幼苗叶片相对含水率和水势的变化CK,control(-0.1 MPa).LD,mild drought(-0.5 MPa).MD,moderate drought(-0.9 MPa).SD,severe drought(-1.5 MPa).Different normal letters indicate significant difference among drought stress treatments before or after rehydration at 0.05 level.Stars*and**indicate significant difference between before and after rehydration in the same drought stress intensity at 0.05(P<0.05)and 0.01(P<0.01)level,respectively.ns indicates no significant difference at 0.05 level(P>0.05).The same as below.Fig.1 The changes of leaf relative water content and water potential of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

复水后,各干旱胁迫处理叶片相对含水率和水势均比其复水前显著提高(P<0.05),但仅轻度胁迫复水后叶片相对含水率和水势均恢复到对照水平,中度和重度胁迫处理仍显著低于对照。

2.2 干旱复水对青冈栎幼苗叶片光合参数和瞬时水分利用率的影响

图2显示,随干旱胁迫加剧,青冈栎幼苗叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)均逐渐降低,气孔限制值(Ls)则逐渐提高,而瞬时水分利用效率(WUE)则先升后降。其中,叶片Pn、Tr、Gs、Ci和Ls在轻度干旱胁迫下均与对照无显著差异,在中度干旱胁迫下除Ci外均与对照差异显著,在重度干旱胁迫下均与对照有显著差异;而叶片WUE 在轻度和中度干旱胁迫下均与对照无显著差异,但重度干旱胁迫下叶片WUE比对照显著降低了24.83%。在复水后,各干旱胁迫处理的Pn、Tr、Gs、Ci和WUE 均比其复水前不同程度增加,而Ls均比其复水前不同程度减少,且轻度和中度胁迫复水前后变幅大多达到显著水平(P<0.05)。同时,在复水后,叶片Pn、Tr、Gs、Ci、Ls和WUE在各干旱胁迫处理间仍存在显著差异(P<0.05)。其中,在轻度胁迫复水后,叶片Pn、Gs、Ci和WUE均比对照有不同程度增加,而Tr和Ls不同程度降低,但仅Pn比对照显著提高了19.93%,其余指标变化均未达到显著水平;在中度胁迫复水后,除Ls比对照显著增加外,其余指标均与对照无显著差异;在重度胁迫复水后,叶片Ls比对照显著增加109.23%,Pn、Tr分别比对照显著降低41.06%和29.27%,其余指标也不同程度降低,但降幅未达到显著水平。

图2 干旱胁迫和复水后青冈栎幼苗叶片光合参数和瞬时水分利用效率的变化Fig.2 The changes of photosynthetic parameters and instantaneous water use efficiency of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

2.3 干旱复水对青冈栎幼苗叶片叶绿素荧光特性的影响

图3 显示,随干旱胁迫加剧,叶片初始荧光(Fo)持续升高,而最大荧光(Fm)持续降低,且中度和重度干旱胁迫与对照差异显著(P<0.05)。在复水后,各干旱胁迫处理的Fo均比其复水前降低,但均未达到显著水平,而Fm均比其复水前显著或极显著增加;与对照相比,复水后各干旱胁迫处理叶片Fo和Fm均不同程度增加,轻度胁迫复水后的Fm显著增加6.27%,中度胁迫复水后的Fo和Fm分别显著增加6.53%和5.63%,重度胁迫复水后的Fo显著增加10.88%(P<0.05)。

图3 干旱胁迫和复水后青冈栎幼苗叶片叶绿素荧光参数的变化Fig.3 The changes of chlorophyll fluorescence parameters of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

图3还显示,随干旱胁迫加剧,叶片最大光化学效率(Fv/Fm)和潜在光化学效率(Fv/Fo)均逐渐降低,且中度和重度干旱胁迫与对照差异显著(P<0.05)。在复水后,各干旱胁迫处理的Fv/Fm和Fv/Fo均比其复水前不同程度提高,轻度胁迫复水后的Fv/Fm比其复水前显著增加6.38%(P<0.05),中度和重度胁迫复水后的Fv/Fo分别极显著增加30.42%和31.50%(P<0.01);复水后各干旱胁迫处理的Fv/Fm和Fv/Fo均与相应对照间无显著差异。

2.4 干旱复水对青冈栎幼苗叶片解剖结构的影响

2.4.1 叶片气孔特征参数

青冈栎幼苗叶片为异面叶,由紧密排列的上表皮细胞、栅栏组织、疏松的海绵组织和下表皮细胞、表皮毛构成,叶脉粗大向下隆起。气孔集中分布在叶片下表皮,且下表皮有表皮毛覆盖(图4)。

St.气孔器;Eh.表皮毛;A1.对照;A2.轻度干旱胁迫;A3.中度干旱胁迫;A4.重度干旱胁迫;B1.复水后对照;B2.复水后轻度干旱胁迫;B3.复水后中度干旱胁迫;B4.复水后重度干旱胁迫。下同。标尺=40μm。图4 干旱胁迫和复水后青冈栎幼苗叶片下表皮气孔St,stomata.Eh,epidermal hair.A1.Contrast.A2.Mild drought stress.A3.Moderate drought stress.A4.Severe drought stress.B1.Rehydration control.B2.Mild drought stress after rehydration.B3.Moderate drought stress after rehydration.B4.Severe drought stress after rehydration.The same as below.Bar=40μm.Fig.4 The leaf stomata on the lower epidermis of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

表1显示,随干旱胁迫加剧,叶片气孔器长度、宽度及气孔开口面积均逐渐减小,而气孔密度大幅度增加,且气孔开口面积和气孔密度在各干旱胁迫处理下均与对照差异显著(P<0.05)。在复水后,轻度、中度和重度干旱胁迫处理气孔器长度、宽度(除中度胁迫复水后)、开口面积和密度均比其复水前不同程度增加,但仅气孔开口面积分别极显著增加66.34%、128.78%、196.74%(P<0.01),其余气孔指标复水前后变化均未达到显著水平。与对照相比,复水后轻度胁迫处理仅气孔器密度显著增加6.07%,复水后中度胁迫处理气孔器宽度和开口面积仍分别显著减少7.45%和26.59%,气孔密度则显著增加13.96%,复水后重度胁迫处理气孔器长度、宽度、开口面积分别显著降低11.14%、8.90%和46.76%,气孔密度显著增加22.13%。

2.4.2 叶片显微结构

图5和表2显示,各干旱胁迫处理叶片厚度均比对照不同程度增加,但仅中度干旱胁迫下显著增加7.49%(P<0.05)。在复水后,各干旱胁迫处理的叶片厚度均比其复水前不同程度增加,但仅重度胁迫复水后叶片厚度比复水前显著增加5.93%(P<0.05)。在复水后,各干旱胁迫处理下的叶片厚度均仍高于对照,但仅中度和重度胁迫复水后叶片厚度分别比对照显著增加9.46%和7.24%(P<0.05)。

U-ep.上表皮;L-ep.下表皮;Pal.栅栏组织;Sp.海绵组织。标尺=50μm。图5 干旱胁迫和复水后青冈栎幼苗叶片肉结构U-ep,upper Epidermis.L-ep,lower-epidermis.Pal,palisade tissue.Sp,sponge tissue.Bar=50μm.Fig.5 Structure of the leaf mesophyll cells of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

同时,随干旱胁迫加剧,叶片上下表皮厚度均显著增加(P<0.05),且上表皮厚度增加更快,轻度、中度和重度胁迫下上表皮厚度分别比对照增加36.53%、56.95%和97.20%。在复水后,各干旱胁迫下的上下表皮厚度均比其复水前不同程度减少,但减幅均未达到显著水平(图5 和表2)。在复水后,叶片上下表皮厚度在各干旱胁迫处理间仍差异显著,轻度胁迫复水后叶片上下表皮厚度均与对照无显著差异,中度胁迫复水后仅叶片上表皮厚度比对照显著增加25.00%,重度胁迫复水后叶片上下表皮厚度分别比对照显著增加66.64%和66.23%(P<0.05)。

另外,随干旱胁迫加剧,叶片海绵组织厚度逐渐显著减小,降幅为10.16%～16.86%;栅栏组织厚度在轻度和中度胁迫下分别比对照显著增加7.74%、13.81%,在重度干旱胁迫下稍有降低;栅海比在各干旱处理下均比对照不同程度增加,但仅在中度干旱胁迫下达到显著水平(P<0.05),增幅达37.23%(图5和表2)。在复水后,各干旱胁迫处理的栅栏组织和海绵组织厚度以及重度胁迫的栅海比均比复水前不同程度增加,而轻度、中度胁迫复水后栅海比均比复水前降低,但仅中度和重度胁迫复水后海绵组织厚度与复水前差异显著(P<0.05),其余指标复水前后变化差异不显著。在复水后,栅栏、海绵组织厚度和栅海比在各处理间及其与对照间均差异不显著。

此外,由图6和表2可知,叶片主叶脉厚度在各处理间差异极显著(P<0.05),在轻度和中度胁迫下分别比对照显著增加5.61%和10.33%,在重度胁迫下则比对照显著减少15.15%;随干旱胁迫加剧,叶脉导管直径有不同程度增加,但各处理间差异不显著。在复水后,各干旱胁迫处理主叶脉厚度和导管直径均比其复水前不同程度增加,且各胁迫处理复水后主叶脉厚度增幅均达极显著水平(P<0.01),轻度和中度胁迫复水后叶脉导管直径增幅也均比达显著水平(P<0.05)。

Xc.木质部导管。标尺=100μm。图6 干旱胁迫和复水青冈栎幼苗叶脉结构Xc,xylem conduit.Bar=100μm.Fig.6 Structure of the leaf main vein of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

在复水后,主叶脉厚度和叶脉导管直径在轻度胁迫复水后分别比对照显著增加10.17% 和17.80%,在中度胁迫复水后分别比对照组显著增加15.21%和20.51%,在重度胁迫复水后,主叶脉厚度比对照减少,叶脉导管直径比对照增加,但均与对照差异不显著。

3 讨论

本研究结果显示青冈栎幼苗通过降低叶水势、关闭气孔、降低蒸腾、改变叶片形态结构等一系列结构和生理机制来适应干旱胁迫,在经受适度干旱后复水可在光合作用、水分利用、叶绿素荧光参数、气孔开口面积等生理活动中产生补偿效应,迅速恢复生长发育,但干旱胁迫强度不同复水后青冈栎幼苗恢复能力有所不同。

光合作用是植物生长发育的基础,干旱胁迫主要通过气孔限制和非气孔限制因素影响其Pn,从而显著影响着植物光合作用正常进行[24]。研究表明,Pn降低的原因可通过叶片Ls和Ci的变化趋势判断;随干旱胁迫加剧,若Pn和Ci降低的同时伴随Ls升高,则Pn主要受气孔因素限制,若Pn和Ls降 低而同时伴随Ci升高或不变则,则Pn主要受非气孔因素限制[25]。本研究发现,青冈栎幼苗Pn、Ci和Gs随干旱胁迫加剧均呈显著下降趋势,而Ls呈显著升高趋势,说明干旱导致其Pn降低主要由气孔限制引起。这与栓皮栎(Quercus variabilisBl.)[11]和柑橘(Citrus reticulataBlanco)[26]上的相关研究结论一致,Pn与Gs、Ci呈显著正相关,说明干旱胁迫使气孔阻力增大甚至关闭,使气孔导度下降,导致叶肉细胞羧化位点的CO2量减少,引起光合速率下降。

此外,青冈栎幼苗通过关闭气孔降低蒸腾速率来减少水分散失,并伴随叶相对含水率和水势显著降低,从而适当增加叶片保水能力,这也是一种生态避旱策略。这与射干(Belamcanda chinensisL.)上的相关研究结果一致[25]。但此避旱策略在不同干旱胁迫强度下作用效果不同,表现出明显的阈值响应,在轻度干旱胁迫下青冈栎幼苗可通过有效降低叶片相对含水率和水势,关闭气孔降低蒸腾速率,将CO2吸收和水分散失稳定在最优状态,提高Pn/Tr比值,从而使瞬时水分利用效率(WUE)升高,提高了青冈栎幼苗对轻度干旱胁迫环境的适应性,幼苗可以健康生长;在中度胁迫下其WUE 开始低于对照;而在重度干旱胁迫时,其WUE 显著低于对照。说明当土壤水势低于-0.9 MPa时,青冈栎幼苗的光合同化能力开始受到抑制,其生产能力降低,幼苗生长缓慢。这与前人对鼓节竹(Bambusa tuldoides‘Swolleninternode’)[27]和文冠果(Xanthoceras sorbifolia)[28]的研究结果相同。

复水可以显著提高各干旱胁迫处理下青冈栎幼苗的光合参数,明显改善了其叶片水分状况,但干旱胁迫强度不同复水后恢复效果不同。轻度干旱胁迫复水后叶片Pn、相对含水率和水势能完全恢复,且Pn显著高于对照,说明轻度胁迫下青冈栎具有较强的旱后恢复能力,且旱后存在补偿生长;在中度干旱胁迫下,尽管青冈栎幼苗叶片Pn也可恢复到对照水平,且WUE也略高于对照,但叶片水分状况未恢复到对照水平,说明这时青冈栎幼苗保水能力开始降低;而重度干旱胁迫复水后的青冈栎幼苗Pn显著低于对照,说明重度胁迫对其叶片的细胞膜造成了一定的损伤,在日后青冈栎幼苗抚育管理中,应避免其遭受中度以上干旱胁迫。

叶绿素荧光参数(Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo)可反映光合作用“内秉性”特点[29]。大量研究发现,植物在遭受轻度干旱胁迫时,叶绿素荧光参数变化不显著,而当植物遭受中、重度干旱胁迫时,Fm、Fv/Fm、Fv/Fo均迅速下降,而Fo则显著升高,光合作用反应中心PSⅡ会出现可逆性的损伤或不可逆的伤害,导致光合原初反应过程受阻,进而降低植物的光合作用效率[7,30-31]。本研究也发现,青冈栎幼苗Fo随干旱胁迫程度加剧呈显著升高趋势,而Fm、Fv/Fm和Fv/Fo呈显著降低趋势,且轻度胁迫下叶绿素荧光各参数与对照差异均不显著,而从中度胁迫开始叶绿素荧光参数变化显著,重度胁迫则进一步加大了叶绿素荧光参数与对照间的显著差异性。说明中度和重度干旱胁迫抑制了青冈栎幼苗PSⅡ反应中心的活性及电子传递,产生了光抑制现象,导致其生长受到一定程度的损害。复水使各干旱胁迫下青冈栎幼苗的Fo比其复水前降低,Fm、Fv/Fm和Fv/Fo则比其复水前有不同程度的增加。其中,轻度胁迫复水后青冈栎幼苗Fo可恢复到对照水平,而其Fm、Fv/Fm和Fv/Fo均达到峰值;中度和重度胁迫复水后其Fo均未恢复到对照水平,仍显著高于对照,且重度胁迫复水后Fv/Fm和Fv/Fo仍均略低于对照,Fv/Fm仅为0.75。说明当青冈栎幼苗遭受中度以上干旱胁迫(-0.9 MPa)时,在解除干旱胁迫后,遭受损伤的光合作用反应中心PSⅡ虽得到了一定程度的修复,但尚未恢复至干旱胁迫前的水平,此时青冈栎幼苗光合作用反应中心受到光抑制,反应中心发生较严重损伤[27]。这与孙娅楠等对棕榈(Trachycarpus fortunei)幼苗的相关研究结论相同[30]。

气孔是植物和外界环境进行气体和水分交换的重要通道,植物对气孔器大小、开口、密度的调节是植物抵御干旱逆境的机制之一[32]。本研究结果显示,青冈栎幼苗气孔主要分布在叶下表皮,这种结构特征既可以保证正常气体交换,同时能抑制水分散失,达到同时提高水分利用率和抗旱能力的目的;此外,本研究中青冈栎幼苗叶片气孔器大小(长度、宽度)、气孔开口面积随干旱胁迫加剧均呈显著减少趋势,而气孔密度则呈极显著增加趋势,说明在干旱环境下,青冈栎幼苗叶片通过小气孔口面积、大气孔密度来降低蒸腾速率、减少水分损失、维持其生理代谢活动,但由于中度和重度胁迫处理叶片气孔口开度(面积)迅速降低,也导致其Pn快速降低,幼苗生长变慢。目前,大量研究发现,不同植物叶片气孔特征应对干旱环境的规律不同,前人对杨树(Populus)[33]和赤皮青冈(Cyclobalanopsis gilva)[34]的研究表明,随干旱胁迫加剧,叶片气孔密度与气孔口开度呈负相关变化,气孔大小和密度与其蒸腾失水量直接相关;同时,气孔密度大在一定程度上有利于光合作用和散热,可避免热害使叶绿体和原生质体发生变性。本研究结果与之一致。但也有不同研究结论,例如何凤等[35]对杜仲(Eucommia ulmoides)研究发现,随干旱胁迫加剧,气孔密度表现为先增加后减少的趋势,而气孔面积、气孔器长宽则表现为增-减-增的变化趋势;Qiang 等研究发现青海云杉(Picea crassifolia)气孔密度随干旱胁迫加剧而降低[36]。因此,不同植物叶片气孔特征对环境条件的响应与适应具有多样和复杂性,还需对其深入研究。在本研究环境条件下,干旱胁迫加剧可能使青冈栎幼苗叶片面积减小[26],导致单位面积的气孔数目增加,使得气孔密度增大;复水未对各干旱胁迫处理下的气孔器长宽以及密度变化产生影响,但复水使青冈栎幼苗气孔开口面积均比其复水前显著提高。其中,轻度干旱胁迫复水后青冈栎幼苗气孔开口面积恢复到对照水平,中度干旱胁迫复水后气孔开口面积还是略低于对照;重度胁迫复水后气孔开口面积则仍显著低于对照,说明当干旱胁迫强度达到中度水平(-0.9 MPa)时,对青冈栎幼苗进行旱后复水,并不能使其气孔开口迅速恢复打开,从而限制了光合作用的恢复。

青冈栎叶片为异面叶,由紧密排列的上表皮细胞、栅栏组织、疏松的海绵组织和下表皮细胞、表皮毛构成,叶脉粗大向下隆起。叶片厚度、表皮细胞、栅栏组织、海绵组织、主叶脉等结构都与植物的抗旱性关系密切。一般而言,栅栏组织越厚,海绵组织越薄,栅海比越大,主脉越粗大、导管直径越大叶片的耐旱性越强,反之,则耐旱性越差[35]。本研究发现,青冈栎幼苗叶片上下表皮厚度随干旱胁迫程度加剧均呈极显著增加趋势,且上表皮厚度增加更多;叶片厚度和栅栏组织厚度均呈先增加后下降趋势,且重度胁迫使叶片栅栏组织厚度低于对照;同时,海绵组织厚度随干旱胁迫加剧呈显著降低趋势,干旱胁迫使其栅海比高于对照,且比值均大于1,并以中度胁迫下栅海比值最大(1.29±0.29),说明在轻度和中度干旱胁迫下,青冈栎幼苗可以更有效通过增加上表皮细胞厚度和排列紧密度、发育发达的叶肉栅栏组织,相对减少海绵组织厚度,提高栅海比,从而增大叶片组织紧密度,避免植物叶肉细胞遭受强光灼伤,同时充分利用衍射光进行光合作用,有利于提高或保持青冈栎幼苗的保水能力和耐旱能力;但通过调节青冈栎叶片结构适应干旱环境的能力是有限的,当干旱胁迫强度到达重度水平时(-1.2 MPa),青冈栎幼苗叶片栅栏组织厚度开始低于对照组,导致栅海比开始降低,其耐旱能力减弱。此外,当干旱胁迫强度达到重度时,青冈栎幼苗的主叶脉厚度开始显著迅速减小,且主脉导管直径并无显著增加,也进一步说明青冈栎幼苗并不能通过迅速改变叶片的细胞结构来适应重度干旱胁迫。有研究表明,叶片主脉的大小跟水分在植物体内的运输效率直接相关,越粗的主脉具备越强的水分控制能力,其可在高温及干旱条件下加快蒸腾,降低叶表温度,从而避免植物体受高温及干旱伤害[34]。尽管复水后,轻度、中度和重度胁迫下青冈栎幼苗叶片厚度、上下表皮、栅栏组织、海绵组织厚度以及栅海比均恢复到或优于对照;但复水后,重度胁迫下青冈栎幼苗主叶脉厚度还仍略低于对照,导管直径也并未显著提高,说明青冈栎幼苗在重度干旱胁迫下经短期复水后导管吸水和输水的恢复能力较弱。

4 结论

青冈栎幼苗叶片在细胞结构、光合作用、叶绿素荧光参数等方面均对干旱胁迫和复水表现出明显的响应。在轻度干旱胁迫下,青冈栎幼苗通过有效改变叶片结构引起叶片生理功能变化,诱发青冈栎幼苗积极的水分应对策略,保证幼苗健康生长,且复水后青冈栎幼苗各指标均优于或恢复到对照水平。在中度干旱胁迫下,青冈栎幼苗主要通过显著增加叶片厚度、主叶脉厚度,以及提高最大栅海比,维持幼苗生长,但其Pn、Gs、Tr、WUE 和部分叶绿素荧光参数均显著降低,其耐旱能力降低,复水后,仅有部分叶片结构指标和光合生理、叶绿素荧光参数恢复到对照水平,说明其旱后恢复能力开始下降。重度干旱胁迫严重抑制青冈栎幼苗气孔口开度,栅海比未显著提高,光合同化能力受到抑制,PSⅡ光系统反应中心受损,但未出现幼苗死亡现象;重度干旱复水后,幼苗叶片各项光合指标均未能恢复到对照水平,Fv/Fm仅为0.75。因此,青冈栎幼苗具有一定的耐旱性和旱后恢复能力,适合作为喀斯特地区的生态恢复树种,但在青冈栎幼苗抚育阶段,应保证土壤水势不低于-0.9 MPa,维持其更强的旱后恢复能力,从而更有利于幼苗生长。