补肾益骨方基于“平衡”理论调节骨代谢抗骨质疏松作用机制*

王一帆，朱学启，邓颖，杨磊，谭云鹏，袁青云，高红瑞

云南省文山州中医医院 云南文山 663099

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是高骨转化代谢失常，致骨量减少，骨质降低引起骨折高发、全身性疼痛等症的代谢性疾病，病因繁多，患病率高[1]。中国成年人OP 患病率约为7%，预测2050 年中国OP 患者可高达5.33 亿。本病是中老年人特别是绝经后妇女的常见病、多发病，超过半数50 岁以上女性受到OP困扰[2]，患者常并发脊柱、股骨、肱骨近端脆性骨折而最终致残、致畸甚至致死。严重危害人类的生活质量并造成巨大经济损失。现代医学治疗主要以补充矿化类制剂、骨吸收抑制药物、骨形成促进药物等方法，长期口服此类药物均有不同程度的不良反应[3-4]，中医药治疗具有作用缓慢持久、整体调节、不良反应小及无明显药物依赖等特点，乃当下较有潜力的治疗方法。课题组前期研究发现补肾益骨方能够有效改善患者骨密度及全身骨关节疼痛等症状，此研究从调节OP 大鼠模型骨代谢平衡方面探讨补肾益骨方抗骨质疏松的作用机制。

材料与方法

1 动物

8 月龄SPF 级SD 大鼠60 只，体重（200g±20）g，在室温18 ～22℃，湿度28%环境中适应性饲养1 周后使用。

2 实验药物及试剂

阳性对照药：阿伦磷酸钠（石药集团欧意药业有限公司，批准文号：国药准字H10980109）；补肾益骨方（盐补骨脂15g，骨碎补30g，盐巴戟天15g，熟地20g，牛膝15g，菟丝子12g，黄芪25g，砂仁10g，红花6g，赤芍15g，炙甘草9g），浸泡30min 后大火煮开，文火煮25min，倒出头煎药液，再次加水大火煮开，文火煮25min，取2 次药液混合。

3 实验仪器

超净工作台，高速冷冻离心机，台式高速离心机，-80℃冰箱，高压灭菌锅，手术操作器械，3%戊巴比妥那，青霉素，骨密度检测仪，PINP、PICP、CTX、NTX 用ELISA 试剂盒，酶标仪，洗板机，恒温培养箱及相关分析软件等。

4 分组与造模

所有大鼠经称重记录后通过随机数字表法分为6个组（空白组，模型组，对照组，高、中、低剂量组）。参考文献[5]除空白组外，所有大鼠均通过去双侧卵巢手术造模。具体步骤：术前12h 禁食，腹腔注射3%戊巴比妥那（30mg/kg）麻醉后切除双侧卵巢（空白组切除卵巢周围脂肪组织），术后青霉素连续注射4 天预防感染。术后大鼠分笼饲养，自由饮水、进食、活动，动物房室温（25±2）℃，相对湿度（60±5）%，每日照明12h。

5 干预措施

5.1 大鼠给药剂量 大鼠每日灌胃量根据动物体表等效剂量换算法计算，参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表[6]，每只动物每Kg 体重给药量按临床人的等效量为中剂量，0.5 倍等效量为小剂量，2 倍等效量为大剂量。

5.2 分组干预措施 从造模后2 周开始即给予药物灌胃干预。每天灌胃1 次，灌胃所用药液均为间接加热法加热摇匀，温服。药物干预持续12 周，对照组根据药物给予阿伦磷酸钠灌胃，模型组予生理盐水等量灌胃。高、中、低剂量组分别根据分组不同给予不同剂量补肾益骨方药液灌胃。

5.3 检测指标 分别于干预12 周后采集大鼠新鲜静脉血液，取血完成后取大鼠股骨组织行HE 检查。血液标本离心后提取血清并检测血清中血Ca、P 浓度，ELISA 法检测I 型前胶原N 端前肽（PINP）、I型前胶原羧基端前肽（PICP）、I型胶原C 端肽（CTX）、I型胶原N 末端肽（NTX）的蛋白表达水平。

6 统计学方法

运用SPSS21.0进行统计学分析，所有计量资料数据以（）表示。所有数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，多组间比较使用One-wayANOVA分析，两两比较采用LSD 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 HE 结果显示股骨病理改变

空白组：骨皮质较厚，骨小梁呈网状排列，结构完整，骨陷窝内骨细胞形态大小正常。模型组：骨小梁稀疏，变细，断裂且排列紊乱，可见大量空骨陷窝，骨小梁间隙增宽，骨细胞萎缩变小。阳性组及各给药组：可见骨小梁较模型组增粗且间隙变小，排列相对规律，骨细胞与骨陷窝见腔隙也明显减小，骨细胞疏松萎缩可见明显改善。其中以中剂量较其他组显著。见图1。

图1 各组股骨病理改变

2 补肾益骨方对OP 大鼠血磷、血钙浓度影响

模型组大鼠血磷、血钙浓度低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高、中、低剂量组和空白组间血钙、血磷浓度差异无统计学意义（P＞0.05）；高、中、低剂量组间血钙、血磷浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 补肾益骨方对OP 大鼠血磷、血钙浓度影响（）

表1 补肾益骨方对OP 大鼠血磷、血钙浓度影响（）

?

3 补肾益骨方对OP 大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 蛋白浓度影响

模型组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 浓度较空白组均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组及低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 浓度较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；同对照组比较，低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 浓度有不同程度的降低，差异有统计学意义（P＜0.05），中剂量组大鼠PICP、CTX、NTX 浓度与空白组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表2，图2。

图2 补肾益骨方对OP 大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 蛋白浓度影响

表2 补肾益骨方对OP 大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 蛋白浓度影响（）

表2 补肾益骨方对OP 大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 蛋白浓度影响（）

?

讨 论

OP 是以骨量减少、骨质受损、骨强度降低，致骨脆性增加而并发脆性骨折为特征的全身性代谢性骨病[7]，绝经后女性的发病率为50.1%[8]，因其高发病、高致残及短期致死率严重危害老年人的健康，逐步发展为全国性的重大疾病。目前认为OP 是多因素综合作用导致的骨重建呈负平衡后所致，如何调节骨代谢，维持“成骨—破骨”平衡成为了抗OP 治疗的关键。研究运用我院验方“补肾益骨方”干预OP 大鼠模型，从钙磷代谢、骨代谢等方面探讨其作用机制。

通过补肾益骨方干预去卵巢OP 大鼠模型，经HE染色观察发现大鼠股骨骨小梁较模型组增粗且间隙变小，排列相对规律，骨细胞与骨陷窝间腔隙明显减小，骨细胞疏松萎缩得以明显改善。说明补肾益骨方可以有效改善OP 大鼠的骨质。从钙磷代谢方面研究发现，模型组血钙、血鳞水平降低，考虑OP 大鼠存在骨代谢活跃，钙、磷吸收障碍。经过药物干预后，虽高、中、低剂量组血钙、血鳞水平同空白组及模型组之间无统计学差异，但比较均值等指标提示各药物干预组较模型组有所降低，提示调节钙磷代谢可能是补肾益骨方抗OP 的机制之一。

I 型胶原是骨矿化环节中唯一的胶原类型，是骨基质的主要构成。成骨细胞含大量I 型前胶原，骨形成时I 型前胶原被大量分泌至胞外，裂解成PICP、PINP和I 型胶原三个片段，可提示成骨的活跃程度，作为骨形成参考指标和抗OP 治疗效果的生化指标[9-11]。I型胶原交联羧基末端肽（CTX）、I 型胶原交联氨基末端肽（NTX）是I 型胶原骨代谢过程的降解产物，骨代谢过程中破骨细胞活跃，骨吸收速率增快的时候会有大量的CTX、NTX 生成并排入血中[12]。是反应骨吸收活跃程度的、的特异性指标[13-14]。本研究初始拟定以上述指标为切入点，期望从成骨代谢及破骨代谢平衡方面入手，探索补肾益骨方抗骨质疏松的机制。研究发现模型组PICP、PINP、CTX、NTX 均明显升高，提示大鼠经去卵巢造模后，成骨细胞及破骨细胞代谢活跃，呈现高骨转换的状态，对照组及低、中、高剂量组大鼠经干预后PINP、PICP、CTX、NTX 浓度较模型组降低，说明通过药物干预后，OP 大鼠的骨转化亢进的状态被遏制；低、中、高剂量组大鼠PINP、PICP、CTX、NTX 浓度较对照组有不同程度的降低，且中剂量组大鼠PICP、CTX、NTX 浓度与空白组相当，说明补肾益骨方对OP 大鼠的骨代谢调节作用比阿仑膦酸钠更好，同时不同剂量的补肾益骨方疗效无明确剂量增加依赖，中剂量组能够调整骨代谢致正常水平。

祖国医学认为，机体健康需要处于阴阳平衡状态，平衡被打破出现偏颇，机体呈病理状态。基于该“平衡理论”本研究采用“取类比象”的方法，将骨代谢中成骨代谢为正面的状态，属阳；破骨代谢为负面状态，属阴。正常的骨代谢平衡是“成骨-破骨”的阴阳平衡。随着人体的生、长、壮、老、已，骨代谢过程中即属阳的“成骨”代谢减弱，与之相对抗属阴的“破骨”代谢相对的呈现出增强趋势，在本就中表现为模型组大鼠CTX、NTX 均明显升高，随着病程的进展，属阴的“破骨”代谢过于增强，机体为纠正这种阴阳属性的偏颇，属阳的“成骨”代谢必然随之亢盛，故在造模成功后，模型组大鼠PICP、PINP 亦有明显升高，但这种亢盛属于阴盛而阳虚亢的表现，而经过“补肾益骨方”干预后OP 大鼠CTX、NTX、PICP、PINP 蛋白浓度均下降，说明经过经过“补肾益骨方”干预后OP 大鼠破骨代谢减缓，成骨代谢“虚亢”的阴阳失衡得以纠正。同时上述指标的改变也提示了OP 大鼠的高骨转化率得到的明显的遏制。说明补肾益骨方能够有效调节OP 大鼠骨代谢，抑制骨质高转化达到抗骨质疏松的目的。

肾虚为OP 的基础病机，拟方中选用阴阳双补的代表方左归丸拟方思路：“善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”[15-16]，同时配伍巴戟天、骨碎补等温补肾阳之品，也是为了达到阴阳平衡的基础。同时OP 发病与脾虚密切相关，可将之归“骨痿”范畴。“脾为后天之本，气血生化之源”“谷入气满，淖泽注于骨”。后天亏虚，则精亏髓空，而百骸痿废[17]，方中使用了黄芪等补脾益气的药物，后天脾胃强生方有精气养骨。中医学“血瘀”学说在OP 发病机制中起着至关重要的作用。“旧血不去新血不生”，瘀血阻滞，本身即无滋养骨骼作用，同时阻滞体内，严重影响骨骼的局部微循环，以致骨组织新血化生缓慢，成骨功能受限[18]，方中加入赤芍、红花等活血化瘀之药，能够“祛瘀生新”，使旧血得去，新血以生，故筋骨得以濡养。现代药理学研究显示左归丸有“类激素”作用，能够调节雌激素水平，降低骨转化率及骨丢失量，且副作用相对雌激素更小[19]。方中单味中药有效成分如骨碎补总黄酮抗绝经后OP 疗效显著且能有效缓解骨痛的临床症状[20]；异补骨脂素能显著促进BMSCs 向成骨细胞分化防治OP[21-22]。黄芪水提液含有多种多糖及皂甙类成分能提高股骨BMD 和降低骨组织氧化应激水平，抑制氧化应激抗OP[23-24]，同时也有学者基于“去瘀生新”基础理论，在抗骨质疏松药物中采用赤芍，红花等活血药物，能够改善局部微循环瘀滞，促进成骨细胞活性及代谢，增加骨量，调节内分泌系统功能紊乱，增强抗OP 作用[25-26]。

综上，补肾益骨方能有效改善去卵巢OP 大鼠模型骨质，其机制与调节OP 大鼠钙、磷代谢，遏制OP大鼠成骨及破骨代谢亢盛，降低骨转化率，恢复机体“阴阳”平衡状态有关，且不同剂量“补肾益骨方”无明确的用药剂量增加依赖趋势，以中等剂量调节骨代谢效果明显。