内环化聚(β-氨基酯)的制备与生物物理性能

雍海洋，李智立，郭 蕊，周德重

（西安交通大学化学工程与技术学院,西安 710049）

聚合物的性能不仅与化学组成和分子量有关，还与聚合物的拓扑结构密切相关.除了常见的线性结构，支化、星形、环状及刷型结构的聚合物近年来备受关注［1～9］.环化聚合物由于其独特的环状结构而具有较小的回转半径和流体力学体积、较低的熔体黏度和较高的热稳定性［10～12］.这类聚合物也逐渐被用于制备热稳定的自组装胶束及低毒性的基因转染材料等［3，13，14］.目前环状聚合物的制备主要有扩环和闭环两种方法.然而由于两种聚合策略均存在局限性，开发易于合成、反应条件温和的制备环化聚合物的方法仍然十分迫切.目前，通过调控聚合反应动力学中生长链的浓度和生长边界，已经实现了采用原子转移自由基聚合（ATRP）和可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合制备内环化的聚丙烯酸类聚合物，它们在基因递送、抗菌涂料、光子晶体水凝胶等应用中展现出优异的性能［4，15～21］.但可控聚合反应条件相对复杂、单体转化率低及聚合物不易降解等问题限制了其进一步应用.

聚（β-氨基酯）由于单体来源广泛、合成条件温和、分子结构易调节、主链易于降解，被认为是一种安全高效的生物材料［3，22～27］.目前，虽然支化结构和星形结构的聚（β-氨基酯）因具备优异的物化性能而被大量应用于基因递送，但对环化结构的聚（β-氨基酯）的研究仍然较少.本课题组［3］通过迈克尔加成反应和自由基引发的闭环策略制备了一种内环化聚（β-氨基酯）（cPBAE）.与线性聚合物相比，环化聚合物由于具有紧密的拓扑结构而具备更强的DNA压缩能力、较小的纳米颗粒尺寸、更高的基因转染效率和较低的细胞毒性.这种方法需要极稀的单体浓度（1×10-6mol/L）以避免分子间发生交联，存在单体转化率低等问题，限制了该方法的规模化应用.本文以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）和4-吗啉丙胺（MPA）为单体，通过调控反应的投料比和单体浓度等条件制备内环化聚（β-氨基酯），利用凝胶渗透色谱仪（GPC）和核磁共振波谱仪（NMR）对聚合物结构和组成进行分析，使用原子力显微镜（AFM）、酸碱滴定、凝胶电泳和阿尔玛蓝染色实验对聚合物的生物物理性能进行分析.结果表明：随着环化度的增加，聚（β-氨基酯）对DNA的压缩能力增强，降解速率加快，质子缓冲能力增加，但对细胞的毒性也增大.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA），纯度95%，上海迈瑞尔生化科技有限公司；4-吗啉丙胺（MPA），分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；支化聚乙烯亚胺（bPEI，Mw=25000），纯度99%，上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO），无水级，上海阿拉丁生化股份有限公司；乙醚，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；二甲基甲酰胺（DMF），色谱级，上海麦克林生化科技有限公司；氘代氯仿（CDCl3），纯度99.8%，上海阿达玛斯试剂有限公司；琼脂糖，生物级，长沙艾科瑞生物科技有限公司；醋酸-醋酸钠缓冲液（HAc-NaAc，pH=5.2，25 mmol/L）、细胞培养液、胰酶和血清，生物级，以色列BI 公司；阿尔玛蓝，生物级，上海源叶生物科技有限公司；DNA，生物级，美国Aldevron公司.

JNM-ECZ400S/L1型核磁共振波谱仪（NMR），日本JEOL公司；Agilent 1260 infinity Ⅱ型凝胶渗透色谱仪（GPC），美国安捷伦公司；Cypher ES 型原子力显微镜（AFM），英国牛津仪器公司；Synergy Hybrid H1型酶标仪，美国Biotek公司；IS128FD型pH仪，上海仪迈仪器科技有限公司.

1.2 实验过程

1.2.1 内环化聚（β-氨基酯）的制备 通过调控TMPTA 和MPA 的投料比制备不同拓扑结构的聚合物.将0.90 g（6.25 mmol）MPA 和1.48 g（5 mmol）TMPTA 溶解在2.38 g DMSO 中用于制备cPBAE-1；将1.44 g（10 mmol）MPA 和1.48 g（5 mmol）TMPTA 溶解在8.76 g DMSO 中用于制备cPBAE-2.于90 ℃反应，待分子量约为8000时停止反应，并将含0.9 g（6.25 mmol）MPA的11 g DMSO加入到反应液中进行室温封端24 h.通过使用乙醚进行沉淀提纯聚合物，于25 ℃真空干燥24 h后放置在-20 ℃冰箱中.

1.2.2 GPC测试 分别取10 mg聚合物样品溶解在1 mL DMF中，经过0.2 μm的滤头过滤后，使用GPC测试数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）、分子量分布（PDI）及Mark-Houwink曲线指数α值.

1.2.3 NMR测试 分别取5 mg聚合物样品溶解在600 μL CDCl3中，通过NMR测试聚合物组成.

1.2.4 AFM表征 首先将聚合物配制成1 mg/mL的丙酮溶液，然后滴在云母片上，挥发约12 h后进行AFM表征.

1.2.5 降解性能评价 将聚合物样品先溶解在DMSO中配制成100 mg/mL的储备液，然后用醋酸-醋酸钠缓冲液稀释到5 mg/mL 并放置在37 ℃的水浴锅中.分别在4，8 和16 h 取1 mL 溶液，冻干处理后用GPC检测分子量.降解度定义为：降解聚合物的分子量除以聚合物的原始分子量.

1.2.6 质子缓冲能力测试 通过酸碱滴定测试聚合物的质子缓冲能力.将50 μL 储备液（100 mg/mL）稀释在30 mL 去离子水中，将pH 值调节至3.0，然后滴加100 μL 浓度为0.01 mol/L 的NaOH 溶液后记录pH值.继续滴加NaOH溶液，直至pH值为10时停止.

1.2.7 凝胶电泳实验 首先将DNA 稀释在10 μL 的醋酸-醋酸钠缓冲液中，然后将聚合物储备液添加到上述溶液中并涡旋15 s后室温孵育30 min.每个样品DNA用量为1 μg，聚合物与DNA的质量比分别设定为5∶1，10∶1和20∶1.将单独的DNA设为阴性对照；bPEI设为阳性对照，bPEI与DNA的质量比设定为10∶1和20∶1.然后将孵育好的样品溶液加入到含SYBR Safe DNA染色剂的琼脂糖凝胶（1%，质量分数）孔中，在120 mV电压下电泳30 min.

1.2.8 细胞毒性评价 使用宫颈癌细胞HeLa进行毒性评价.将细胞以20000个/孔的密度接种在96孔板上，待细胞汇合度达到80%左右时进行后续实验.将100 mg/mL的聚合物样品储备液0.1，0.2，0.5和1.0 μL稀释在100 μL培养基中，得到聚合物浓度为100，200，500和1000 μg/mL的培养基溶液，涡旋10 s后，将含聚合物的培养基添加到孔内，在37 ℃的培养箱中培养24 h后测定细胞毒性.弃去旧培养基，加入100 μL 用PBS 稀释的阿尔玛蓝（质量分数10%）溶液后，继续在37 ℃的培养箱中培养40 min，然后使用酶标仪测试荧光强度（λex/λem=530/590）.没有经过聚合物处理的细胞荧光强度定义为100%，同时使用浓度为100，200和500 μg/mL的bPEI作为对照组.

2 结果与讨论

2.1 cPBAE的表征

利用GPC和1H NMR对聚合物的分子量和化学结构进行表征.图1为不同条件下制备的cPBAE的GPC 曲线，分子量在6300～8800 之间，cPBAE-2 的分子量分布比cPBAE-1 窄，这是由于cPBAE-1 的分子量相对较大造成的.通过Mark-Houwink 曲线的指数α值分析聚合物的拓扑结构，一般线性聚合物的α值介于0.5～1.0之间，而环化聚合物的α值会低于0.5［15，24］.从表1 可知，cPBAE-1 的α值为0.29，而cPBAE-2的α值是0.40，所以cPBAE-1 的环化度大于cPBAE-2.

Table 1 GPC and 1H NMR results of cPBAE-1 and cPBAE-2

Fig.1 GPC trace of cPBAE-1(a) and cPBAE-2(b)

图2（B）和（C）分别为cPBAE-1和cPBAE-2的1H NMR 谱图.cPBAE-1中［MPA］/［TMPTA］化学组成比高于投料比，cPBAE-2 中［MPA］/［TMPTA］化学组成比低于投料比（表1）.cPBAE-1 中［MPA］/［TMPTA］化学组成比为1.46，低于cPBAE-2的1.59，说明MPA更多地参与形成环化结构，而非线性结构，进一步证明cPBAE-1 的环化度大于cPBAE-2.上述结果表明，通过控制单体的投料比和浓度可以得到cPBAE.与传统的“活性/可控”聚合方法制备内环化聚合物主要通过调控单体与链转移剂或者引发剂投料比以及单体浓度相比［4，15，17，21］，通过一步法迈克尔加成反应制备不同环化度聚合物的条件更加温和，成本更低，更利于规模化生产，且更易于调控聚合物的环化度.

Fig.2 Chemical structure of cPBAE(A) and 1H NMR spectra of cPBAE-1(B) and cPBAE-2(C)

图3（A）和（B）分别为cPBAE-1和cPBAE-2的AFM图片.cPBAE-1既有圆形又有椭圆形的颗粒，而且颗粒尺寸分布较宽，这可能是由于两种聚合物具有不同的亲水性，cPBAE-2比cPBAE-1含有更多的MPA组分，因此具有相对更强的亲水性，在制备AFM测试样品干燥过程中，不同分子间更难团聚，因而呈现出更加均一的形貌和更小的颗粒尺寸.

Fig.3 AFM images of cPBAE-1(A) and cPBAE-2(B) nanoparticles

2.2 降解性能

由图4可见，聚合物在醋酸-醋酸钠缓冲液中可以发生降解，导致分子量降低.其中cPBAE-1的降解速率更快，4 h后，分子量即降低为原分子量的一半，而cPBAE-2需要8 h分子量才降低为原分子量的一半.16 h后，cPBAE-1和cPBAE-2的分子量分别减少了约80%，表明cPBAE可以在短时间内降解，这将有利于降低聚合物的细胞毒性.

Fig.4 Degradation profiles of cPBAE-1(a) and cPBAE-2(b) in HAc-NaAc buffer(A) and the corresponding degree of degradation(B)

目前环化聚合物的主链多为碳-碳键，降解性能差，引入二硫键可以提高聚合物的降解能力［18］.cPBAEs的主链结构含有大量酯键，能够在水中通过自发水解而发生降解，从而降低聚合物在细胞体内富集而导致的细胞毒性.因此，该类内环化聚合物不仅合成方法简单，而且具备潜在的生物医学应用价值.

2.3 质子缓冲能力

聚合物的质子缓冲能力与聚合物颗粒在溶酶体中的逃逸能力紧密相关，具有强质子缓冲能力的聚合物能够有效地保护所递送的药物分子，避免被溶酶体降解.由图5 可见，bPEI 由于有大量的三级氨，其质子缓冲能力最强.cPBAE-1 的质子缓冲能力比cPBAE-2强，这是因为MPA更多地参与到成环过程而形成了大量的三级氨；而环化度低意味着更多的MPA位于聚合物链末端而没有转化为三级氨.这表明环化度更高的聚（β-氨基酯）具有更多的三级氨和更高的质子缓冲能力，从而具有更强的溶酶体逃逸能力.

Fig.5 Proton buffering capacity of cPBAE-1(a),cPBAE-2(b) and bPEI(c)

2.4 DNA压缩性能

作为基因递送的第一步，聚合物对DNA的压缩能力直接影响其基因负载量和对基因的保护能力.图6（A）示出了cPBAEs和bPEI在不同条件下对DNA的压缩能力.bPEI在聚合物/DNA质量比为10∶1和20∶1 条件下都具有优异的DNA 压缩能力而没有观察到明显的DNA 迁移条带；与cPBAE-2 相比，cPBAE-1的DNA压缩能力更强，其中聚合物/DNA质量比为20∶1时的结果优于5∶1时的，说明增加聚合物的用量可以提高其对DNA的压缩性能.

Fig.6 DNA condensation capacity of cPBAEs and bPEI at various mass ratios(A) and cell viability of HeLa cells after incubation with cPBAEs and bPEI(B)

2.5 细胞毒性

由图6（B）可以看出，在24 h内，cPBAEs 对细胞的毒性较低，而经bPEI 培养后细胞成活率只有不到10%.随着聚合物浓度增加，cPBAE-2仍然呈现较低的细胞毒性，即使在1000 μg/mL 的高浓度条件下，细胞成活率也几乎没有受到影响.相反，cPBAE-1随着聚合物的浓度增加而呈现出一定的毒性，但在500 μg/mL下细胞成活率仍然保持在90%左右，当聚合物浓度为1000 μg/mL时，细胞成活率降低至60%，说明环化度增加会增加cPBAEs的细胞毒性.与bPEI相比，cPBAEs只有在极高的浓度下才表现出一定的细胞毒性，这主要归因于其良好的自发水解性能，表明cPBAEs 在生物医学领域具有应用潜力.

3 结论

拓扑结构作为影响聚合物性能的重要参数之一受到了越来越多的关注.本文通过调控聚（β-氨基酯）合成过程中的单体投料比得到环化结构的聚合物.研究结果表明：较低的［MPA］/［TMPTA］投料比和较高的单体浓度可制得环化度高的聚合物cPBAE-1，其Mark-Houwink曲线α值为0.29，聚合物为圆形和椭圆形颗粒，分布较宽；相反，较高的［MPA］/［TMPTA］投料比和较低的单体浓度可制得环化度较低的聚合物cPBAE-2，其Mark-Houwink曲线α值为0.40，聚合物为圆形颗粒.此外，研究结果还表明，随着环化度的增加，聚（β-氨基酯）对DNA压缩能力增强，降解速率加快，质子缓冲能力增加，但毒性更高.