寄生于金鱼肌肉和肝胰脏的吴李碘泡虫形态特征与分子鉴定

王小亮，曹 欢，王 姝，吕晓楠，王静波，张 文，王 澎，徐立蒲

(北京市水产技术推广站，北京 100176)

碘泡虫是黏孢子虫中最大的类群，全世界已报道的有850余种，中国记录的有320多种，其中寄生于鲫(C.arassius)的碘泡虫最多，有50余种[3]。碘泡虫可寄生于鱼类和两栖类的各类组织中，有些种具有宿主或组织特异性，在寄主组织大量寄生时可引起严重的疾病。以往对碘泡虫的研究主要围绕其在经济鱼类的危害，分析碘泡虫的寄生部位，描述造成的症状，并通过形态学特征对其进行分类研究。随着分子生物学技术的应用，分子鉴定方法为碘泡虫的分类鉴定提供了重要补充，并为碘泡虫的中间宿主生活阶段研究和新种的发现提供了便捷方法。已报道的感染金鱼的碘泡虫种类有异样碘泡虫(M.diversus)[4]、洪湖碘泡虫(M.honghuensis)[5]、晶壳缝碘泡虫(M.lentisuturalis)[6]、卡特碘泡虫(M.cultus)[6]、红河碘泡虫(M.hoabinhensis)[7]、吴李碘泡虫(M.wulii)[8]和关桥碘泡虫(M.gua-nqiaoensis)[9]等。2021年9月，在北京市通州区相邻的两家观赏鱼养殖场发生孢子虫病，感染部位分别为肝胰脏和肌肉。为鉴定病原种类，通过采集样品，利用形态学特征和18S rDNA等方法进行鉴定，明确金鱼所感染的孢子虫种类，旨在丰富金鱼孢子虫病的资料。

1 材料方法

1.1 实验金鱼

2021年9月，取北京市通州区两家相邻观赏鱼养殖场的发病金鱼样品，其中一家金鱼品种名称为鎏金，病鱼头背部呈瘤状隆起，样品编号为BTXD210907；另一家金鱼品种名称为草金鱼，腹部膨大，样品编号为BTXL210907。病鱼体长均约10 cm、体质量约40 g，采样时水温约21 ℃、溶解氧浓度为7.5 mg/L、pH为8.1。

1.2 方法

1.2.1 样品采集和保存

样品(BTXD210907和BTXL210907)金鱼解剖后，肉眼观察各组织白色包囊存在的情况，然后制作鳃丝、肌肉瘤状隆起组织、肝胰脏、肾、脾、性腺等组织的水封片进行孢子虫镜检。观察到孢子虫的样品组织，BTXD210907样品取肌肉瘤状隆起流出液及周边肌肉组织；BTXL210907样品取肝胰脏组织，匀浆后添加95%乙醇进行固定，固定后的样品组织均于-20 ℃保存。

1.2.2 孢子虫形态学观察和形状测量

取95%乙醇固定的样品(BTXD210907和BTXL210907)，制作水封片，置于ZEISS AxioLab.A1显微镜下观察孢子虫形态，采用ZEN 2.3图像软件拍照，测量孢子虫长(Spore length，SL)、孢子虫宽(Spore width，SW)、孢子虫厚度(Sporozoite thickness，ST)、极囊长(Polar capsule length，PCL)、极囊宽(Polar capsule width，PCW)，以及确定极丝圈数(Polar filament coil，PFC)，每个样品测量20个虫体。

1.2.3 孢子虫18S rDNA的克隆与测序

1)DNA提取

分别取95%乙醇固定的样品(BTXD210907和BTXL210907)20 μL，用500 μL超纯水充分冲洗，再以5 000 r/min离心5 min，舍弃上清液，重复3次。采用DNeasy Blood &Tissue Kit (Qiagen，德国)试剂盒，按照说明书抽提基因组DNA，并置于-20 ℃保存备用。

2)PCR扩增

用于扩增18S rDNA的引物参考Andree K B等[10]设计的碘泡虫属的通用引物For：5’-CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT-3’、Rev：5’-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3’进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系组成：2×Taq PCR Mix 25 μL、25 μmol/L上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经纯化后，送至上海生工生物工程技术公司进行基因序列测定。

1.2.4 系统发育树的构建与分析

将测序样品(BTXD210907和BTXL210907)的18S rDNA基因序列提交至GenBank数据库，获得基因登录号。同时，将两条序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，从中选取与所获序列同源性较高的同种虫的18S rDNA基因序列，并从GenBank数据库中获得相关属的18S rDNA序列，利用MEGA 4.0、邻位连接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树。通过自举分析进行置信度检测，自举数集1 000次。以武汉单极虫的18S rDNA序列为外源序列。

1.3 数据处理

样品(BTXD210907和BTXL210907)的孢子虫长、宽和极囊长、宽的测量数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析两样品之间及大、小极囊之间的差异，以P<0.05为显著。

2 结果与分析

2.1 病鱼临床症状

发病金鱼均出现不摄食、打蔫、离群独游等行为特征。发病的鎏金(BTXD210907)头背部两侧有一对瘤状大囊泡(图1A)，剪开后流出白色黏稠液，肌肉组织糜烂成糊状，制备的组织水浸片镜下可见包囊和大量的孢子虫(图2)；肝胰脏部分呈白色，取该组织制作水浸片，在显微镜下可见包囊和大量孢子虫；其他组织未见包囊和孢子虫。发病的草金鱼(BTXL210907)腹部膨大，解剖后见肝胰脏呈灰白色、体积严重增大(图1B)，制备的组织水浸片镜下可见有包囊和大量孢子虫(图3)，鳃和其他内脏组织未见包囊和孢子虫。

2.2 孢子虫形态特征分析

在显微镜下观察样品孢子虫，可见孢子虫壳面观呈梨形，前端略尖，后端钝圆；拥有2个大小略有差异的极囊，位于虫体前端，呈“八”字形排列(图4)。样品BTXD210907的孢子虫平均长为(17.58±0.85)μm、平均宽为(11.02±0.58)μm、平均厚为(8.68±0.42)μm，大极囊平均长为(8.82±0.48)μm、平均宽为(3.88±0.27)μm，小极囊平均长为(8.35±0.48)μm、平均宽为(3.83±0.25)μm，极丝圈数为7～9圈；样品BTXL210907的孢子虫平均长为(18.09±0.54)μm、平均宽为(11.82±0.44)μm、平均厚为(8.82±0.52)μm，大极囊平均长为(8.25±0.16)μm、平均宽为(3.92±0.26)μm，小极囊平均长为(7.95±0.31)μm、平均宽为(3.53±0.26)μm，极丝圈数为7～9圈(表1)。经单因素方差分析两样品的孢子虫在虫体长、虫体宽、极囊长和极囊宽上的差异均不显著(P>0.05)，同一样品的大极囊长和宽与小极囊的差异均也不显著(P>0.05)。

表1 感染金鱼组织的孢子虫形态特征Tab.1 Morphological characteristics of Myxobolus spp. isolated from diseased goldfish

注：A为光学显微镜下孢子虫的形态(1 000×)；B为单孢子经数码放大的形态。Notes:A.Spore morphology under a light microscope(1 000×);B.A spore magnified by a digital zoom.

2.3 孢子虫18S rDNA基因分析

将样品(BTXD210907和BTXL210907)测序的孢子虫18S rDNA片段提交至GenBank，获得的登录号分别为OR133488和OR133489。经Blast同源性检索，两株孢子虫18S rDNA 序列与吴李碘泡虫的同源性最高，达99%以上；与塔形碘泡虫(M.pyramidis)的同源性约94%；与洪湖碘泡虫和瓶囊碘泡虫(M.ampullicapsulatus)的同源性约92%。系统发育树也显示，两株孢子虫均与吴李碘泡虫聚为一枝，如图5所示。因此，确认北京市通州区两家相邻观赏鱼养殖场的金鱼发生的孢子虫病的病原为吴李碘泡虫。

3 讨论

3.1 碘泡虫的形态特征与分类鉴定

碘泡虫种类繁多、种间结构相似，孢子虫的形态特征与寄生组织专一性易受到寄生宿主品种不同和环境差异的影响。在没有分子生物学数据佐证的前提下，仅依靠形态学特征、寄生宿主或寄生部位以及发病症状，不足以确诊病原。例如，先前的研究认为寄生于中国金鱼鳃和肝胰脏的吴李碘泡虫、寄生于异育银鲫的关桥碘泡虫以及寄生于日本金鱼鳃的碘泡虫未定种形态特征相同，但因宿主或寄生部位的不同而被定为3个不同的种。随后，2009年Zhang J Y等[9]通过形态特征和分子生物学数据证实三者均为吴李碘泡虫。本研究中寄生于金鱼肌肉的孢子虫和寄生于金鱼肝胰脏的孢子虫与Zhang J Y等[9]报道的吴李碘泡虫的形态特征相似，与日本金鱼(C.auratusauratus)肝胰脏来源株[9]、湖北异育银鲫(C.auratusgibelio)肝胰脏来源株[9]和重庆鲫(C.auratusauratus)鳃来源株[11]在形态度量上存在一定的差异(表2)。因此，还应考虑利用分子生物学技术等分类方法进行佐证[12]，必要时分子生物学方法需同时采用多个基因[13]。本研究中，两株孢子虫的18S rDNA序列均与吴李碘泡虫的同源，相似性达99%以上；构建的系统发育树也表明，其与吴李碘泡虫聚为一枝，因此结合形态特征，可以确定这两株孢子虫均为吴李碘泡虫。2019年，杨承忠等[11]通过比较长江流域吴李碘泡虫的三大地理株系，发现各地理株系在形态量度上存在一定的差异，但从分子水平上看，均为种内水平的形态变异，认为吴李碘泡虫的种内形态度量差异可能与地理环境、宿主种类及感染部位有关。本文也验证了这一结论。

3.2 吴李碘泡虫的寄生部位

已有学者证实吴李碘泡虫可寄生于金鱼的鳃、肝、肝胰脏、脾和腹腔[9]。本次从样品BTXD210907金鱼的背部肌肉检测到吴李碘泡虫，其系统发育树与已报道的肝胰脏寄生株聚为一枝，而鳃寄生株(GenBank登录号为MH920541和MH920542)在另一枝；同时，在该样品的肝胰脏也检测到虫株，而肝胰脏的位置在空间上与头背部肌肉较近。这表明寄生于金鱼肌肉的吴李碘泡虫可能是寄生于其肝胰脏的虫株不断适应进化的结果。结合已报道的吴李碘泡虫在金鱼的寄生部位，进一步说明吴李碘泡虫不具有寄生组织专一性的特点。此外，已有文献报道，碘泡虫属的其他种也可寄生于金鱼肌肉，如Caffara M等[6]发现晶壳缝碘泡虫可寄生于金鱼头背部肌肉并形成瘤状泡；Chinh N N等[7]在野生金鱼的躯干肌肉中检测出红河碘泡虫。但至今未见吴李碘泡虫寄生于鲫或金鱼肌肉的报道，因此本文发现的吴李碘泡虫寄生于金鱼肌肉属首次报道，这丰富了吴李碘泡虫在金鱼寄生部位的数据资料。

4 碘泡虫的防治建议

在碘泡虫防治方面，碘泡虫等黏孢子虫类的体表被有几丁质壳片，药物不易渗透，耐药力很强，因此目前还未发现治疗黏孢子虫病的特效药物。陈昌福等[14]曾分别试验了有效成分为阿苯达唑、地克珠利、敌百虫、盐酸氯苯胍、左旋咪唑、槟榔粉、百部粉和孢虫净等商品药物对异育银鲫黏孢子虫的治疗效果，但没有一种药物对治疗有效。本文采用国家许可水产养殖上使用的地克珠利进行治疗，拌饵用药每月连用7 d，持续半年，并配合及时捞走病鱼等措施，取得较好的效果。高志鹏[15]分别采用桉树油、盐酸氯苯胍、敌百虫、青蒿素、牛至油、百里香酚、香芹酚进行体外杀灭洪湖碘泡虫试验，结果发现桉树油、青蒿素、敌百虫对洪湖碘泡虫的存活率没有影响，盐酸氯苯胍具有一定的杀灭作用，牛至油及其两种主要成分香芹酚和百里香酚都具有较好的杀虫效果，其中以香芹酚杀虫效果最好，这为快速治疗孢子虫病提供了可能。