赤水河河源段鱼类资源现状调查

陈文善，陈泊霖，卢 群，刘建虎*，何 滔，杨 峰

(1.长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区云南管护局，云南 昭通 657000；2.西南大学水产学院，重庆 400715；3.枞阳南方材料有限公司，安徽 铜陵 246700)

生物通过产生粪便、尿液、唾液、皮肤细胞的方式将DNA排出或脱落到周围环境中，这类大量存在于环境中的DNA片段总和被称为环境DNA (Environmental DNA，eDNA)[6]。eDNA技术是指直接从水体、土壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段，然后通过DNA测序和qPCR等分子生物学检测技术来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研究方法。该方法应用在鱼类资源调查上具有一定的创新性，调查过程不依赖动物样本，不受禁捕的限制，可以大量采样[7]；eDNA技术进行资源调查相对传统调查成本较低，对分类学鉴定专业知识要求较低，生态环境侵入性低、影响较小[8]；eDNA技术能检测出传统鱼类多样性调查手段难以捕获的物种，但因假阳性和DNA污染等情况的存在，其适合作为鱼类资源调查的一个重要补充手段[9]。利用eDNA进行资源调查不能完全替代传统的鱼类调查方法，但该技术具有对生物体以及生态环境无害、操作简单、高灵敏度以及高检测率等诸多优势，随着数据库的持续完善，其适用性会越来越强[10]。

本次调查采用传统捕捞方式和采集水样检测环境DNA相结合的技术方法，于2020—2021年对赤水河河源段的鱼类资源现状进行调查，分析其种类组成和数量结构、优势种、生物多样性及鱼类栖息分布状况，既弥补了传统捕捞方法调查不够全面的不足，也在一定程度解决了eENA技术出现假阳性的问题，旨在为保护区鱼类生物多样性保护提供管理依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在赤水河河源段的保护区水域布设18个调查站位(表1)，其中赤水河干流10个、支流8个，利用笼壶、抛撒掩网和定置三重刺网3种类型渔具对该区域的鱼类进行捕捞。同时在赤水河河源段主要支流及干流设置的18个采样点中选取7个点(鱼洞、罗甸、小三峡、天生桥、石坎、河口、苦竹塘)采集eDNA水样。

表1 赤水河河源段鱼类资源调查站位分布表Tab.1 Characteristics of biodiversity monitoring stations

续表1

1.2 样品鉴定与检测

对采集到的渔获物进行现场鉴定，并测量体长和体质量，对于疑难物种采用甲醛固定后带回鉴定。标本鉴定和分类主要依据《四川鱼类志》[11]、《长江鱼类》[12]、《贵州鱼类志》[13]、《中国内陆鱼类物种与分布》[14]。

eDNA水样按照Omega Soil DNA Kit试剂盒提取DNA，同时利用液氮进行保存，再带回实验室，并利用MiFish引物扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带检测浓度。如满足条件则运用高通量测序 (High-throughput sequencing，HTS)技术，同时对环境样本中存在的多个物种进行识别[15]。满足检测条件后随机检测样本OTU数并绘制OTU稀疏曲线，若有OTU无法比对至种的水平，则向上一级如属、科等进行统计[16]。

1.3 数据分析

使用相对重要性指数(IRI)[17]计算鱼类群落优势种的成分：

IRI=(N+W)×F

(1)

式(1)中：N为某种鱼类尾数占总尾数的百分比；W为某种鱼类重量占总重量的百分比；F为某种鱼类在调查站位出现的次数占在总站位中的百分比。将IRI>1 000的种类作为优势种；100

采用Shannon-Wiener多样性指数(H′)[18]、Margalef种类丰富度指数(D)[19]和Pielou均匀度指数(J)[20]研究调查海域鱼类群落的生物多样性，计算公式如下：

(2)

D=(S-1)∕lnW

(3)

J=H′/lnS

(4)

式(2)～(4)中：S为调查所获鱼类种数；W为该调查总渔获重量；Pi为第i种重量占总渔获重量的比例。

2 结果与分析

2.1 种类组成

表2 调查期渔获物名录Tab.2 List of catch during monitoring period

续表2

表3 渔获物结构Tab.3 Structure of the catch

eDNA技术分析检测出鱼类4目8科38属40种，其中石坎共有鱼类3目8科17属17种；河口共有4目8科20属21种；苦竹塘共有3目7科17属17种；小三峡共有4目8科25属28种；天生桥共有3目7科18属18种；罗甸共有3目7科30属34种；鱼洞共有4目8科19属19种(表4)。

表4 基于eDNA检测各站位的鱼类序列比对结果Tab.4 Sequence alignment results of fish based on eDNA detection at each station

2.2 鱼类资源分布特征

本次调查以2020年为主，因甲方资金问题，而顺延至来年，但2021年采样期间为雨季，因此渔获物少，导致无法作多样性分析。在2020年度调查期间采集鱼类19种，占本次调查总数的82.6%，其中铜车河采集鱼类13种，占总数的56.5%；倒流河采集鱼类5种，占总数的21.7%；石坎河采集鱼类3种，占总数的13.0%。各河段鱼类组成存在差异，干流>铜车河>倒流河>石坎河，干流鱼类物种更加丰富。

调查期间干流各个站点平均鱼类捕获重量为2 636 g，个体全长分布在2.1～37.0 cm之间，大个体占比较高；铜车河站点平均鱼类渔获重量为748 g，个体全长分布在2.8～22.5 cm之间；倒流河站点平均鱼类渔获重量为242 g，个体全长分布在4.6～13.5 cm之间；石坎河上游各个站点平均鱼类渔获重量为58.5 g，个体全长分布在4.0～15.0 cm之间；支流受流量、饵料生物及生态环境因素影响，其鱼类个体整体偏小。干、支流在鱼类资源量方面存在差异。

2.3 鱼类多样性分析

Shannon-Wiener多样性指数基于物种数量反映群落种类多样性，群落中生物种类增多代表了群落的复杂程度增高，即H′值愈大，群落所含的信息量愈大[18]。2020—2021年度调查河段渔获物Shannon-Wiener多样性指数为2.99，表明该河段总体鱼类资源相对丰富，群落结构相对稳定。Margalef丰富度指数指一个群落或环境中物种数目的多寡，亦表示生物群聚(或样品)中种类丰富度程度的指数[19-21]。调查河段总渔获物Margalef丰富度指数(D)为3.31，表明调查区域鱼类资源种类数相对丰富，生物多样性结构相对完好，鱼类组成及种群结构稳定。Pielou均匀度指数(J)是一个用于反映物种个体数目在群落中分配的均匀程的指数[19-21]，调查河段总渔获物均匀度指数为0.66，种群结构分布较均匀，群落结构稳定(表5)。

表5 渔获物生物多样性指数Tab.5 Biodiversity indexes of catches

基于eDNA检测各站位的鱼类群落多样性指数分析结果如表6所示，从中可知，鱼洞、罗甸和小三峡的鱼类多样性更加丰富，鱼洞位于调查区干流上游，罗甸位于调查区干流中游，小三峡位于调查区干流下游，其他采样点则是分布于主要支流。调查区域干流的鱼类资源比支流区域更丰富，鱼类多样性也更高。

表6 基于eDNA检测各站位的鱼类群落多样性指数Tab.6 Fish community diversity indexes based on eDNA detection at each station

3 讨论

本次eDNA调查，共检测出4目8科28属40种。考虑到网具、捕鱼技术、鱼类生活习性和鱼类数量等因素，利用eDNA检测的种类数较传统捕捞方式更加全面。郭宁宁等[24]利用eDNA技术于2021年9月对赤水河流域开展了鱼类多样性、分布及其特征调查，设置了52个采样点，其采样点设置比本研究eDNA技术调查采样点(7个)多45个，共调查到6目18科62属77种鱼类，比本次河源段调查(40种)多出37种。经分析，存在差异可能是郭宁宁等[24]调查的范围更大，调查频次更加密集，且调查区域不同导致的。本次调查区域部分支流存在水量较少等情况，几条支流存在只有雨季才有的现象，这部分支流的鱼类多样性不高，鱼类资源不够丰富，导致调查出的鱼类种类数量较少。本研究eDNA分析结果显示，罗甸和小三峡的鱼类种类最多，分别为34种和28种，其中罗甸采样点处于妥泥河河口处，小三峡处于干流下流区域。干流区域的鱼类种类更加丰富，与渔获物种类分析结果一致。

在2020—2021年调查过程中，小三峡、鱼洞调查点基因含量水平较高，物种相对丰富，而且小三峡段还检测到部分洄游性鱼类基因片段，证明赤水河下游鱼类在繁殖季节可上溯至此，下一步应有针对性地加强重点物种调查，加强保护措施。在上游鱼洞调查水域检测到有铜鱼基因片段信息，可能是放流品种在此区域活动停留导致的。在检测过程中检测到四大家鱼、鲤、鲫和鲟鱼，可能是养殖或者食用品种基因片段混杂导致的。考虑到采样点的分布集中在干、支流区域，因此分别对干、支流的资源量进行统计，发现干、支流在鱼类资源量方面存在显著差异，干流的鱼类种类数目比支流更加丰富，同时在干、支流的同种类鱼类中，干流的鱼体显著大于支流，推测是受流量、饵料生物、生态环境因素和保护力度的影响。在后期鱼类多样性保护上，应加强干流保护区核心区的保护，逐步加强支流资源量恢复措施，提升整体资源水平。