紫外分光光度法快速测定绿叶菜中硝酸盐含量的技术步骤优化

包蔚 徐桦 朱晓芸 何锴 余海芬 吴真善 黄明皓 王络绎

（上海市嘉定区农业技术推广服务中心，上海 201800）

目前绿叶菜中硝酸盐含量的测定方法主要有紫外分光光度法、酚二磺酸比色法、镉柱或镉粒还原分光光度法、离子色谱法等[1]。其中，酚二磺酸比色法是测定绿叶菜中硝酸盐含量的经典方法，但该方法操作烦琐、干扰因素多，不能满足常规分析的需要；镉柱还原分光光度法是检测蔬菜中硝酸盐含量的国家标准方法[2]，此方法以金属镉还原NO3-为NO2-为原理，操作步骤繁多，且在还原时镉粒量要充足，否则易造成测定结果偏低；离子色谱法对仪器的要求较高，且所用试剂有毒，对环境和操作人员均有不良影响；紫外分光光度法具有操作简单、结果准确度高的特点，更符合常规检测安全、快速、大批量的要求。鉴于此，笔者采用紫外分光光度法，通过比较不同提取方法、不同振荡时间和干扰物质等不同测定条件对绿叶菜中硝酸盐含量测定的影响，并对不同测定条件下的检测精密度及准确度进行分析和评价，以期优化测定步骤，从而为绿叶菜中硝酸盐含量的检测提供更为简便快捷的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试样品为2022年随机采自上海设施菜地的新鲜蔬菜，包括生菜、青菜、菠菜、空心菜、芹菜、米苋、杭白菜等。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：氨缓冲溶液（pH为9.6～9.7）、饱和硼砂溶液、0.25 mol/L 亚铁氰化钾溶液、l mol/L 乙酸锌溶液、500 mg/L 硝酸盐标准溶液、活性炭、正辛醇。

主要仪器：紫外分光光度计、分析天平、粉碎机、恒温振荡器、匀浆机。

1.3 实验方法及原理

紫外分光光度法测定绿叶菜中硝酸盐含量是利用提取液提取出硝酸盐，然后加入活性炭去除色素，加入蛋白质沉淀剂去除蛋白质及其他干扰物质，再利用硝酸根离子在紫外区219 nm 处具有吸收波长的特性，测定提取液的吸光度，从而计算出硝酸盐含量。

1.3.1 样品制备

选取一定数量具有代表性的供试样品，先用自来水冲洗，再用去离子水清洗干净，吸干表面水分，切碎后置于粉碎机中匀浆，匀浆后在其中加1 滴正辛醇，以消除泡沫。

1.3.2 硝酸盐提取

饱和硼砂提取：称取15～20 g 匀浆试样，加入饱和硼砂溶液2.5 mL，再加入70～80 ℃的热水40 mL，然后置于沸水浴中加热15 min，持续搅拌。待溶液冷却后，冲洗入250 mL 容量瓶中，加入0.25 mol/L 亚铁氰化钾溶液5 mL，摇匀，再加入1 mol/L 乙酸锌溶液5 mL、活性炭1 g，然后定容到刻度，摇匀、过滤。同时做空白试验。

氨缓冲液提取：称取10 g 匀浆试样，置于100 mL 烧杯中，用100 mL 去离子水分次将样品转移到250 mL 容量瓶中，再加入5 mL 氨缓冲溶液、2 g粉末状活性炭，在可调式往返振荡机上（200次/min）振荡30 min，然后加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各2 mL，充分混合后，加去离子水定容至250 mL，充分摇匀，放置5～10 min后过滤。同时做空白试验。

1.3.3 硝酸盐与亚硝酸盐含量的测定

吸取上述提取液2～10 mL 置于50 mL 容量瓶内，用去离子水定容。用1 cm 石英比色皿，于219 nm处测定吸光度。蔬菜中的亚硝酸盐含量采用国标GB/T 15401-94 中盐酸萘乙二胺比色法进行测定。

1.3.4 工作曲线的配制

分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 硝酸盐标准溶液置于50 mL 容量瓶中，加去离子水定容至刻度并摇匀，此标准系列溶液的硝酸根有效成分质量分数分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。用1 cm 石英比色皿，于219 nm处测定吸光度，以标准溶液的有效成分质量分数为横坐标、吸光度为纵坐标绘制工作曲线。

1.3.5 计算公式

样品中硝酸盐含量以质量分数(单位：mg/kg)表示，计算公式W=(C×V1×V3)÷(m×V2），式中，C为从工作曲线中查得的测试液中的硝酸盐质量分数(mg/L)，V1为提取液定容体积（mL），V2为吸取滤液体积（mL），V3为待测液定容体积（mL），m是样品质量(g）。

2 结果与分析

2.1 饱和硼砂提取法和氨缓冲液提取法比较

选取新鲜生菜和菠菜作为供试材料，分别采用饱和硼砂提取法和氨缓冲液提取法测定其硝酸盐含量，每处理重复4次。由表1可知，饱和硼砂提取法测得的生菜和菠菜中硝酸盐含量的平均值分别为2 809.19 mg/kg 和862.45 mg/kg，而氨缓冲液提取法测得的生菜和菠菜中硝酸盐含量的平均值分别为2 948.16 mg/kg 和873.69 mg/kg，氨缓冲液提取法测得的绿叶菜中硝酸盐含量略高于饱和硼砂提取法，但两者差异不显著。氨缓冲液提取法的变异系数低于饱和硼砂提取方法，且氨缓冲液提取法的操作步骤比饱和硼砂提取法的操作步骤简单。因此，本研究最终选取氨缓冲液提取法来提取绿叶菜中的硝酸盐。

表1 不同提取方法对硝酸盐含量测定的影响

2.2 振荡时间对硝酸盐含量测定的影响

对于实验室大批量快速检测来说，提取时震荡时间越长，检测耗时越长。为确定样品中硝酸盐是否已被完全提取，本试验设振荡时间分别为0、10、20、30、40 min，共5 个处理，每处理重复4次。由表2可知，各振荡时间测得的硝酸盐含量为3 613.31～3 745.86 mg/kg，其中，硝酸盐含量平均值最大的处理为振荡20 min，最小的处理为振荡0 min，但各处理间差异不显著，且变异系数均小于10%。以上结果说明，振荡时间对硝酸盐含量测定结果的影响不大，且没有呈现出硝酸盐含量随振荡时间增加而递增的规律。

表2 不同振荡时间对硝酸盐含量测定的影响

2.3 亚硝酸盐的干扰实验

鉴于亚硝酸盐在219 nm 处有吸光度，会干扰硝酸盐含量的测定结果，故选取新鲜的青菜、空心菜、芹菜、米苋、杭白菜进行亚硝酸盐含量的测定。由表3可知，新鲜蔬菜的亚硝酸盐含量很少，相较于硝酸盐含量来说，亚硝酸盐含量几乎可以忽略不计。因此，亚硝酸盐含量对硝酸盐含量的测定结果基本没有影响。

表3 蔬菜中硝酸盐含量与亚硝酸盐含量比较

2.4 准确度、精密度实验

取青菜、空心菜、生菜、芹菜4种新鲜蔬菜样品，分别加入2 000 mg NO3-，与样品测定步骤一样测定硝酸盐含量，计算回收率。由表4可知，4种蔬菜的回收率在92.61%～109.50%，符合实验要求。

表4 准确度实验结果

取青菜、米苋、杭白菜各2个品种，每个品种设4 个重复，精密度结果如表5所示。由表5 可知，各蔬菜中硝酸盐测定结果的变异系数均小于10%，符合实验要求。

表5 精密度实验结果

3 结论与讨论

通过比较实验，本研究最终选取氨缓冲液作为提取液，并采用摇匀代替振荡30 min 的方式，优化了紫外分光光度法测定绿叶菜中硝酸盐含量的技术步骤；通过测定亚硝酸盐含量，排除了干扰因素；经过准确度和精密度实验表明，优化后的测定方法的加标回收率在92.61%～109.5%，符合实验要求。综上，经过完善和优化技术步骤后的测定方法，大大节省了检测时间，适用于实验室大批量绿叶菜样品的检测。需要注意的是，本方法并不适用于所有绿叶菜样品的测定；同时，在新鲜绿叶菜中亚硝酸盐的含量较低时，立即检测不会干扰检测结果，但是一旦样品保存时间过长，或存储温度过高，亚硝酸盐含量便会在1～2 d内增加，那么硝酸盐含量则会减少，最终便会影响检测结果的准确度[3]。因此，新鲜蔬菜在采样后要尽快进行测定，若当天不能完成检测，须将其置于冷冻条件下保存。