模拟失重对小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学功能的影响

李 萌，张 舒，胡泽兵，孙 权，徐丽群，张正祥，石 菲

(1延安大学医学院，陕西 延安 716099；2空军军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西 西安 710032)

航天实践和地面研究已证实，失重和模拟失重可诱导多种免疫反应，对机体的固有免疫和特异性免疫均产生不利影响[1]。免疫系统是航天飞行中受影响最严重的系统之一。免疫功能的下降增加了航天员机体发生感染、肿瘤、过敏和自身免疫性疾病等的可能性[2]。目前，免疫功能下降的机制尚未被完全阐明，而免疫细胞对微重力环境异常敏感。重力的改变可以通过不同的机制影响免疫细胞的多个方面[3]。先天免疫细胞作为人体免疫防御的第一道防线，在识别和清除抗原异物、保护机体免受外界侵袭等方面发挥着重要作用[4]。巨噬细胞作为重要的先天免疫细胞，具有细胞吞噬、抗原呈递和细胞因子分泌的功能，可影响炎症反应、组织重塑和修复，是先天免疫功能的主要执行者[5]。但在航天失重环境下，巨噬细胞的功能变化特点研究一直没有得到足够重视。因此，本研究拟借助2D回转器模拟失重生物效应，探讨模拟失重对小鼠巨噬细胞生物学功能的影响，为深化失重下人体免疫功能抑制机制研究提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠白血病病毒诱发的肿瘤巨噬细胞RAW264.7(中国科学院上海细胞库)，DMEM培养基、青-链霉素双抗(美国Gibco公司)，胎牛血清(以色列VivaCel公司)，2D回转器(中国航天员科研训练中心)，Transwell小室(8 μm孔径，美国康宁公司)，CCK-8试剂(西安米鼠生物公司)，EdU-594细胞增殖检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒、结晶紫染液(上海碧云天公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 冷冻保存的RAW264.7小鼠巨噬细胞在复苏后，使用含有100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青-链霉素双抗的DMEM培养基进行常规细胞培养。将细胞放置于37 ℃恒温箱，保持50 mL/L CO2浓度，并每日更换培养基1次。当细胞汇合度达到约80%时，使用细胞刮刀进行传代处理。选取复苏后3～6代处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞模拟失重实验 利用2D回转器模拟失重环境，进行细胞培养实验。将RAW264.7细胞接种于25 cm2专用回转培养瓶中，每瓶细胞密度为1×105，待细胞附着在瓶壁上后，用培养基灌满培养瓶并加盖密封塞，确保完全消除气泡。接下来，在2D回转器中放置培养瓶，以24 r/min的速度围绕水平轴旋转72 h，作为模拟失重组(SMG组)。对照组(NG组)置入同一环境中静置培养相同时间，不进行回转。

1.2.3 CCK-8法检测RAW264.7细胞活力 模拟失重72 h后，将SMG组和NG组细胞接种于96孔板后，将板置于37 ℃、50 mL/L CO2箱中，待细胞达到60%～70%后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，2 h后，使用酶标仪测定A450 nm值，实验重复3次。

1.2.4 EdU染色法检测RAW264.7细胞增殖能力 在模拟失重72 h后，将SMG组和NG组细胞接种于经高压灭菌处理的细胞爬片6孔板中。当细胞处于对数生长期且贴壁后，向细胞中加入EdU试剂，孵育2 h。随后，固定细胞并进行30 min的破膜处理。接下来，根据说明配置EdU反应溶液，在避光条件下进行30 min反应。最后，对细胞进行染核、洗涤和封片处理。使用荧光显微镜进行观察并随机获取5个视野，用ImageJ软件计数EdU阳性细胞的荧光图像，实验重复3次。

1.2.5 细胞划痕实验 在模拟失重72 h后，将SMG组和NG组的细胞接种于6孔板中，然后将其置于37 ℃、50 mL/L CO2的环境下进行培养。直到细胞密度达到80%～90%时进行实验。在6孔板底画一条横线，然后在孔内垂直横线处用10 μL无菌枪头划痕。之后，轻柔地用无菌PBS洗去刮下的悬浮细胞，并加入无血清培养基进行培养。在培养0、12 h后分别于倒置显微镜下观察并拍照，然后用ImageJ软件测量划痕面积。

1.2.6 Transwell小室检测细胞迁移能力 将SMG组和NG组细胞制备成细胞悬液后，分别加入到小室的上室中，加入培养基(无血清)于下室中。将小室放置在50 mL/L CO2、37 ℃的条件下培养12 h，然后取出小室，用PBS清洗干净后，用棉签擦干小室上层的内面。用40 g/L多聚甲醛固定细胞，将其保持在溶液中30 min后，用结晶紫染色30 min，然后用去离子水冲洗未迁移的细胞，并用棉签擦去，待其自然干燥后，在显微镜下观察并记录细胞数量。

1.2.7 DCFH-DA荧光检测细胞内ROS含量 模拟失重72 h后取SMG组和NG组细胞接种于6孔板，置37 ℃、50 mL/L CO2下培养，待细胞贴壁后进行实验。根据试剂盒的要求，在适当的条件下于原位装载探针，并使用无血清培养基以1∶1 000比例稀释。将细胞培养液清除后，加入1 mL稀释后的DCFH-DA，将样品放置在37 ℃、50 mL/L CO2的细胞培养箱中孵育20 min。处理完成后，使用无血清培养基对细胞进行3次洗涤，以充分清除未进入细胞内的DCFH-DA，以防止液体荧光强度本底过高。使用激光共聚焦显微镜观察各组的荧光强度。

2 结果

2.1 模拟失重对RAW264.7巨噬细胞增殖能力的影响

为了探究模拟失重是否影响巨噬细胞的增殖能力，将RAW264.7细胞置于2D回转器中培养72 h后进行检测，EdU染色结果显示，NG组EdU掺入RAW264.7细胞核的量更多(P<0.01，图1A～B)；CCK-8实验结果显示，相对于NG组，SMG组增殖能力减弱(P<0.05，图1C)。上述结果均表明，模拟失重对RAW264.7巨噬细胞增殖能力具有抑制作用。

A：EdU法测定细胞增殖率(标尺为20 μm)；B：EdU阳性细胞统计图(bP<0.01 vs NG组)；C：CCK-8法测定细胞增殖速率(aP<0.05 vs NG组)。NG组：对照组；SMG组：模拟失重组。

2.2 模拟失重下RAW264.7巨噬细胞迁移能力增强

为探究模拟失重是否会影响巨噬细胞的迁移能力，将RAW264.7细胞置于2D回转器中培养72 h后，分别通过细胞划痕实验(图2A～B)和Transwell实验(图2C～D)检测模拟失重对其迁移能力的影响。两组实验结果均显示，与NG组相比，SMG组细胞迁移运动能力增强(P<0.05)。

A：划痕创伤愈合实验；B：NG组和SMG组12 h的相对迁移率；C：Transwell迁移实验；D：NG组和SMG组12 h的细胞迁移数。标尺为100 μm。NG组：对照组；SMG组：模拟失重组。aP<0.05 vs NG组。

2.3 模拟失重抑制RAW264.7巨噬细胞分泌ROS

为探究模拟失重对巨噬细胞分泌ROS的影响，将RAW264.7细胞置于2D回转器中培养72 h后，探针DCFH-DA标记细胞，利用激光共聚焦显微镜观察发现：NG组绿色荧光标记的阳性细胞较多，且在视野中平均分布，而SMG组几乎没有绿色荧光标记的细胞，视野内只有极低量的荧光分布(图3A)。对ROS阳性细胞进行平均荧光强度计算，两组存在显著差异(P<0.01，图3B)。

A：72 h模拟失重后DCFH-DA标记情况(标尺为20 μm)；B：细胞分泌ROS的平均荧光强度(bP<0.01 vs 对照组)。NG组：对照组；SMG组：模拟失重组。ROS：活性氧。

3 讨论

既往研究显示，航天飞行中和飞行后1周，航天员会出现感染性疾病，包括结膜炎、急性呼吸道感染、牙齿感染等，也曾有航天员在飞行中发生了正常情况下少见菌导致的尿路感染[6]。此外，航天飞行还会使航天员体内潜伏的病毒再活化，它不仅可能造成包括神经系统在内的全身重要脏器出现功能性损伤，还增加了恶性肿瘤的发病概率[7]。因此，失重环境下机体的免疫调节与控制逐渐成为航天医学领域关注的热点问题之一。巨噬细胞是非特异性免疫中的一种重要细胞，它可以通过抗原提呈和释放细胞因子来激活特异性免疫应答，并在许多生理过程中发挥作用[8]。鉴于此，已有学者针对失重/模拟失重对巨噬细胞的影响开展了相关研究，发现巨噬细胞不仅对重力变化敏感，而且细胞功能会呈现出多种改变[9]。然而，由于各项研究使用的细胞来源、微重力模拟平台以及实验变量之间存在差异，很难直接对既往研究结果进行直接比较分析，且研究结果之间也存在结论不一致甚至是相互矛盾的情况[10]。因此，我们利用课题组长期使用的2D回转器细胞模拟失重模型，对RAW264.7巨噬细胞的增殖、迁移、ROS分泌等基本生物学功能进行了实验探究，期望为深化失重环境下航天员免疫功能改变的具体机制提供理论依据和数据支撑。

巨噬细胞是先天免疫反应中不可或缺的重要成员，在调节炎症过程中发挥着至关重要的作用[11-12]。它们积极参与免疫反应的所有阶段，从引发炎症、触发适应性免疫反应，到清除细胞碎片和消解炎症，其增殖的正常过程与在炎症调控中发挥的功能密切相关[13-14]。重力改变对巨噬细胞增殖能力的影响说法不一，ARMSTRONG等[15]研究曾报道在太空飞行6～7 d后小鼠骨髓衍生的巨噬细胞增殖增加，而HATTON等[16]则报道，与地面对照相比，太空飞行中U937细胞的增殖能力显著降低。巨噬细胞对外界环境变化颇为敏感，在航天飞行搭载实验中，由于受到飞行中振动、噪声、电磁、辐射等多种环境因素的影响，细胞的表现较地面实验更复杂多变。地面模拟失重效应，可有效排除其他物理环境因素的影响，突出单一因素对细胞的干预效果。本研究中，我们采用2D回转器培养RAW264.7巨噬细胞，地面模拟失重72 h后，RAW264.7细胞的增殖受到显著抑制。这一结果表明，巨噬细胞对重力变化敏感，模拟失重对细胞增殖具有抑制作用。

巨噬细胞在炎症的发生、传播和消退过程中扮演重要角色，有研究显示巨噬细胞迁移过程功能障碍与感染易感性增加有关[17]。因此，失重/微重力暴露是否会影响巨噬细胞迁移，也受到研究者关注。现有报道大多聚焦于通过观察巨噬细胞骨架和黏附分子等的变化，来间接推测其迁移能力的变化情况，例如：研究较多的是细胞粘附分子ICAM-1，TAUBER等[18]报道了在国际空间站上培养的原代人巨噬细胞ICAM-1表达减少，而PAULSEN等[19]报道在亚轨道飞行的微重力下，以及在回转器模拟的微重力下，U937巨噬细胞ICAM-1的表达增加。还有报道指出，微重力导致的ICAM-1表达改变是快速、可逆的，并与细胞骨架功能有关。细胞骨架对于保持细胞形态、细胞迁移和信号传导等方面有着重要的功能，同时是巨噬细胞变形和迁移运动的结构基础[20]。巨噬细胞结构和细胞骨架的变化情况与失重/微重力暴露时间有关，短时失重/微重力作用下，细胞结构改变往往是一过性的，例如：在亚轨道飞行实验中，达到微重力的几秒钟内，原代培养的人巨噬细胞细胞骨架发生变化，细胞核体积、表面积都增加，但在几分钟内就会适应并恢复到暴露前状态[21]。而长时间的失重/微重力暴露对巨噬细胞结构的影响有所不同，用旋转壁式回转系统模拟失重培养U937巨噬细胞72 h，导致细胞骨架排布紊乱、肌动蛋白表达减少，同时伴有细胞增殖能力减弱[22]。在上述研究中，研究者习惯于根据巨噬细胞结构、细胞骨架系统的改变，来推测失重/微重力对其迁移运动能力的影响。利用细胞划痕实验与Transwell小室实验，这个实验能够更直观地展示模拟失重刺激后RAW264.7巨噬细胞迁移运动能力的变化特征，这是本实验的优势之一。下一步可继续分析检测与巨噬细胞迁移运动关联密切的信号转导途径，探究模拟失重致RAW264.7迁移能力增强的分子调控机制。

ROS是人体正常进行有氧代谢时产生的一类物质，它们含氧并且性质活泼。在正常细胞中，ROS作为氧化代谢过程的副产物，处于一个动态而稳定的平衡状态，ROS的稳态有助于维持健康细胞中的氧化还原平衡[23-24]。巨噬细胞中ROS的信号传导和破坏特性可以驱动炎症反应以及由炎症引起的疾病。ROS浓度对巨噬细胞的极化产生明显的影响，高浓度的ROS通过诱导巨噬细胞向M1型(促炎性)极化，促进炎性细胞因子的释放，进而发挥促炎作用；而低浓度的ROS则能够调节巨噬细胞朝向M2型(抗炎性)极化[25-26]。因此巨噬细胞释放ROS不仅是先天免疫反应的关键要素之一，也是抵抗微生物入侵人体的最重要屏障。在微重力条件下，巨噬细胞产生ROS的氧化爆发反应受到抑制[18，27-29]。ADRIAN等[27]报告了在回转模拟失重和抛物线飞行实验中，巨噬细胞分泌ROS减少，且在几秒钟内可逆。THIEL等[29]也报道了在国际空间站上NR8383大鼠肺泡巨噬细胞ROS的立即抑制，而随后快速适应。已有的报道均提示微重力下ROS分泌减少导致巨噬细胞相关功能被抑制。本研究中我们将RAW264.7巨噬细胞置于2D回转器模拟失重培养72 h，ROS释放受到显著抑制，与其他研究报道的结果相似。说明失重/微重力可以影响巨噬细胞释放ROS，从而增加机体对疾病的易感性。

巨噬细胞作为适应性免疫反应的启动者和执行者，在免疫耐受、炎症反应、吞噬凋亡细胞等多种生理过程中发挥重要作用[30]。巨噬细胞功能障碍与自身免疫性疾病的发生发展密切相关。在本研究中我们发现回转模拟失重影响了RAW264.7巨噬细胞的生物学功能，主要表现是细胞增殖和ROS分泌受到抑制，细胞的迁移运动能力增强。现阶段失重/微重力对巨噬细胞的影响及其具体分子机制尚未被完全阐明，本文报道的实验进展和结果发现，可以为进一步深化失重环境下航天员免疫功能抑制机制研究提供理论依据和数据支撑。