无创产前检测在筛查胎儿染色体拷贝数变异中的应用价值分析

彭 圆,黄晓莉

(淮安市妇幼保健院医学遗传与产前筛查科,江苏 淮安 223002)

染色体拷贝数变异(chromosome copy number variations,CNVs)一般是指整倍体、非整倍体等染色体数目异常以外,由染色体结构片段变异引起的遗传性疾病,通常又称为染色体微缺失微重复。由于CNVs可以影响受精卵形成过程中遗传物质信息错误传递,也是导致不孕不育、受孕后自然流产及出生缺陷等不良事件的原因之一。已有报道的致病性CNVs近300种,合并发病率近0.17%(1/600)[1]。无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)技术是从孕妇外周血中提取胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA),通过新一代高通量测序技术,再结合生物信息分析,得出cffDNA相对量,计算出胎儿染色体异常的风险率。在本研究前期进行的NIPT中发现,除常规的21三体、18三体、13三体等染色体数目异常及性染色体疾病具有较高的阳性预测值外[2],染色体拷贝数的缺失或重复也具有较高的阳性预测值。因此,本研究选择在淮安市妇幼保健院行NIPT且结果提示可能为胎儿CNVs的孕妇为研究对象,对其产前诊断结果及妊娠结局进行回顾性分析,探讨NIPT技术在筛查胎儿CNVs中的应用价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

2018年1月至2021年7月在淮安市妇幼保健院进行NIPT的孕妇有21 389例,选择NIPT结果提示可能为胎儿CNVs的224例孕妇为研究对象;对其中171例孕妇进行了羊水穿刺及进一步的产前诊断[羊水染色体核型分析及染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis,CMA)],所有171例接受产前诊断的孕妇均签署羊水穿刺知情同意书,告知羊水染色体核型分析及CMA的价值及局限性,获得胎儿羊水样本171例。孕妇的年龄为21～46岁,平均为(25.2±3.2)岁;孕周为19～31周,平均为(23.1±2.1)周。通过门诊和电话随访等方式对所有研究对象进行妊娠结局和新生儿情况的随访。

纳入标准:单胎,自然妊娠的孕妇在1年内未接受过输血、移植手术或细胞治疗。排除标准:孕妇血清TORCH检测结果阳性,夫妻双方已知存在染色体数目或结构异常。

本研究已通过淮安市妇幼保健院医学伦理委员会批准(编号:2019036)。

1.2 方法

1.2.1 NIPT方法

在无菌条件下,随机抽取孕妇外周血10mL,送遗传实验室进行测序,测序设备为北京博奥生物集团有限公司的高通量测序仪(BioelectronSeq 4000),DNA提取试剂盒(磁珠法)为广东博奥木华基因科技有限公司生产。使用生物信息软件对测序结果进行分析,获取样品染色体所占比例的Z值信息,以|Z|=3为风险截断值,|Z|<3时判定为染色体非整倍体低风险,|Z|≥3时判定为染色体非整倍体高风险。对于21三体、18三体、13三体出具正式报告,其他染色体数目或结构异常出具辅助报告。对于所有NIPT提示21三体、18三体、13三体高风险或者其他染色体可能存在异常的孕妇,建议进一步进行遗传咨询、产前诊断和超声系统筛查。

1.2.2羊水穿刺术及染色体核型分析和CMA

在行羊水穿刺术前,应用彩色多普勒超声探查确定穿刺点,避开胎盘、胎儿,消毒、铺巾、进针,抽得2份20mL羊水样本,其中1份按照规范进行羊水细胞培养、中期染色体核型制备及核型分析,另1份按照试剂盒的操作说明进行规范的基因组DNA提取,通过质检后,用单核苷酸微阵列技术(Affymetrix CytoScan 750K)进行胎儿羊水CMA。

根据羊水穿刺结果从胎儿CNVs的不同类型和CNVs的不同片段两方面进行分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 24.0统计学软件对所有数据进行分析,计数资料以例数(n)和百分率(%)表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NIPT结果及产前诊断结果的比较

在21 389例孕妇中,经NIPT提示可能为胎儿CNVs的孕妇共有224例,其检出率为1.05%(224/21 389),对171例孕妇进行了羊水穿刺及进一步的产前诊断,穿刺率为76.34%(171/224),其中95例确诊为胎儿CNVs,总阳性预测值为55.56%(95/171)。

根据CNVs不同类型分组,NIPT检出情况显示,微缺失组占所有CNVs的54.02%(121/224),微重复组占所有CNVs的39.73%(89/224),微缺失合并微重复组占所有CNVs的6.25%(14/224),见表1。

表1 不同类型CNVs的检出及诊断情况

根据CNVs不同片段分组,NIPT检出情况显示,>10Mb组占所有CNVs的18.75%(42/224),5～10Mb组占所有CNVs的20.54%(46/224),<5Mb组占所有CNVs的60.71%(136/224),见表2。

表2 不同片段CNVs的检出及诊断情况

2.2 胎儿CNVs的阳性预测情况

在CNVs不同类型组中,微缺失组NIPT与羊水穿刺诊断结果符合51例,阳性预测值为56.67%;微重复组NIPT与羊水穿刺诊断结果符合36例,阳性预测值为50.70%;微缺失合并微重复组NIPT与羊水穿刺诊断结果符合8例,阳性预测值80.00%,三组间阳性预测值比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 CNVs不同类型和片段阳性预测值的比较

在CNVs不同片段组中,>10Mb组NIPT与羊水穿刺诊断结果符合21例,阳性预测值为56.76%;5～10Mb组NIPT与羊水穿刺诊断结果符合21例,阳性预测值为60.00%;<5Mb组NIPT与羊水穿刺诊断结果符合53例,阳性预测值为53.54%,三组间阳性预测值比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

在CNVs片段<5Mb组中,检测出2例CMA结果未见异常,但羊水染色体核型分析结果提示异常,1例为9号染色体臂间倒位,核型结果为46,XN,inv(9)(p11q13);另1例为2号与3号染色体间的平衡异位,核型结果为46,XN,t(2;3)(q37;p11)。

2.3 产前诊断结果有关的妊娠结局情况

根据羊水穿刺结果显示,确诊胎儿CNVs共95例,经过与细胞基因组阵列的国际标准(international standards for cytogenomic arrays,ISCA)等数据库比对分析,将所检出CNVs的性质分为5类:致病性、可能致病性、意义不明确、可能良性、良性[3-4]。

在经过羊水穿刺进行染色体核型分析和CMA确诊的95例胎儿CNVs中,致病性CNVs占33.68%(32/95),可能致病性CNVs占21.05%(20/95),意义不明确CNVs占41.05%(39/95),可能良性CNVs占4.21%(4/95),无良性CNVs病例。

根据产前诊断结果,结合后续的超声筛查,有38例孕妇选择了优生引产,其中致病性CNVs引产27例,可能致病性CNVs引产10例,意义不明确CNVs引产1例,无可能良性CNVs和良性CNVs引产病例,见表4。

表4 CNVs的产前诊断结果及妊娠结局(n)

2.4 对NIPT提示为胎儿CNVs孕妇的随访情况

对NIPT提示为胎儿CNVs的224例孕妇进行电话或者门诊随访,其中有31例因拒绝门诊就诊或就诊后电话随访不配合导致失访,随访率为86.16%(193/224);但接受羊水穿刺的孕妇随访率为100.00%。对于产前诊断结果CNVs虽然为致病性和可能致病性,但选择继续妊娠的15例孕妇进行了随访和详细记录,见表5。

表5 产前诊断结果为致病性和可能致病性CNVs未引产孕妇的妊娠结局

在致病性CNVs中选择继续妊娠的孕妇共5例,有3例经对父母进行CMA验证发现CNVs来自母源,有2例拒绝验证,5例新生儿中均未见明显异常表型。

在可能致病性CNVs中选择继续妊娠的孕妇共10例,有3例经对父母进行CMA验证发现CNVs分别来自父源、母源、新发突变;验证为新发突变的10号病例,新生儿出生后表现为智力低下合并肌张力低,另外2例新生儿中均未见明显异常表型。10号病例的染色体核型分析及CMA结果显示,胎儿在2号染色体2q12.1q14.3区段存在21.9Mb片段的重复(见图1),内含BCL2L11(603827)、PAX8(167415)、GLI2(165230)等74个孟德尔(OMIM)基因;该片段内包含了累及BCL2L11基因的2q13复发性区域[2q13 recurrent region(includes BCL2L11)]。

注：A为10号病例的染色体核型分析结果:46,XY,1qh+,dup(2)(q12q14),箭头表示异常染色体核型位置;B为10号病例的CMA结果:arr[hg19]2q12.1q14.3(10,2974,221-124,876,241)×3。

在可能致病性CNVs并选择继续妊娠的10例孕妇中,有7例拒绝验证,1例为孕晚期死胎,1例新生儿出生后表现为智力低下(1号病例),另外5例新生儿中均未见明显异常表型。1号病例的染色体核型分析及CMA结果为5号染色体5p15.33p14.2区带缺失1个拷贝,长约23Mb(见图2),该缺失在Decipher数据库中记录与行为异常、全面发育迟缓、新生儿张力减退、面容异常、心脏形态异常、不对称性身材矮小、认知障碍、多发畸形等有关。5p部分单体综合征又称猫叫综合征,是最典型的染色体缺失综合征,是由染色体5p部分或完全缺失引起的。

注：A为1号病例的染色体核型分析结果:46,XN,del(5)(p14.2p15.3),箭头表示异常染色体核型位置;B为1号病例的CMA结果:arr[hg19]5p15.33p14.2(38,139-23,389,253)×1。

3 讨论

3.1 NIPT相对于传统筛查的优点

相较于传统的血清学筛查,NIPT对于胎儿染色体疾病筛查方面检测准确度更高,检测范围更全面,同时因其具有无创、方便、快捷的优点,已经广泛应用于临床。随着新一代高通量测序技术的发展,除了胎儿染色体非整倍体等数目异常外,NIPT还能检测出胎儿CNVs。目前,对于NIPT胎儿染色体数目异常方面的研究很多,但关于NIPT应用于胎儿CNVs检测的报道相对较少[5]。本研究经NIPT提示可能为胎儿CNVs的孕妇检出率为1.05%(224/21 389),与文献报道[6-10]的NIPT对胎儿CNVs的检出率为0.175%～1.600%相符。本研究中经羊水穿刺产前诊断后得到的阳性预测值为55.56%(95/171),与丁昭宁等[11]报道的60.0%基本一致。充分肯定了NIPT在胎儿CNVs筛查方面的应用价值。

3.2 NIPT检测结果的病例分析

随着NIPT的广泛应用,其检测范围从常见的21三体、18三体和13三体等染色体疾病,逐渐扩展到了CNVs的检测,从而进一步减少了染色体疾病胎儿的出生。本研究中的10号病例,羊水穿刺染色体核型分析及CMA结果显示,胎儿在2号染色体2q12.1q14.3区段存在21.9Mb片段的重复,其内包含了BCL2L11(603827)、PAX8(167415)、GLI2(165230)等74个孟德尔(OMIM)基因。有研究显示,在发育迟缓、畸形等临床表型患者中检测到累及BCL2L11基因的2q13区段的重复,部分患者为遗传自表型正常或者轻微异常的父母(PMID:21255006,26227573);其中PAX8基因杂合突变与常染色体显性遗传的先天性非甲状腺肿的甲状腺功能减退2型疾病有关,临床表型包括不能生长发育、智力障碍、甲状腺功能减退等;GLI2基因杂合突变与常染色体显性遗传的前脑无裂畸形9型疾病有关,临床表型包括前脑无裂畸形、垂体发育不全伴全垂体功能减退、轴后多指畸形等[4]。也有研究显示,在身材矮小、小头畸形、短头畸形、先天性青光眼、智力障碍等临床表型的患者中检测到2q11.2q14.2区段的重复;该病例经父母CMA验证后确定为新发突变及可能致病性CNVs,随访胎儿出生后的临床表型,与羊水穿刺分析结果相符[12]。

3.3 NIPT对于CNVs的验证价值分析

有研究显示,NIPT对于胎儿CNVs检出率与母体血浆中cffDNA含量及CNVs片段不同大小密切相关[13]。本研究中根据CNVs不同类型分组,NIPT对于微缺失、微重复、微缺失合并微重复三组间阳性预测值分别为56.67%、50.70%、80.00%,其中微重复组的阳性预测值最低、微缺失合并微重复组的阳性预测值最高,但三组间阳性预测值比较差异无统计学意义,可以认为NIPT对于微缺失、微重复、微缺失合并微重复三组间的检测价值方面无区别,国内外文献中从该角度报道的可查询文献较少。本研究中根据CNVs不同片段分组,NIPT对于>10Mb、5～10Mb、<5Mb三组间阳性预测值分别为56.76%、60.00%、53.54%,其中<5Mb组的阳性预测值最低、5～10Mb组的阳性预测值最高,但三组间阳性预测值比较差异无统计学意义。这与张颖等[14]的研究结果一致。

3.4 NIPT假阴性与假阳性的分析

本研究中进行羊水穿刺的171例孕妇,羊水染色体核型分析及CMA确诊CNVs共95例,结果阴性76例。分析NIPT在检测染色体片段发生假阳性与假阴性的原因,可能是由于cffDNA浓度过低、限制性胎盘嵌合(1%～2%概率)、母体染色体异常、NIPT测序深度不够、测序数据量不足等因素导致[15-17]。2015年,国际产前诊断学会(International Society for Prenatal Diagnosis,ISPD)更新了NIPT的检测指南,提出对于NIPT范围的扩大应当限制在研究相对明确的且有异常临床表型微缺失或者微重复综合征,对于NIPT提示可能为CNVs异常的孕妇,必须建议其进行规范的超声筛查及侵入性产前诊断,以获取胎儿样本进行确诊,对于部分产前诊断结果还要进行父母CMA的验证。

综上所述,利用NIPT对于胎儿CNVs进行初步筛查是有效且可行的[18-19],特别是对致病风险≥5Mb的CNVs[20]。对于有CNVs异常风险的胎儿,在经产前诊断后应及时给予干预,建议终止妊娠。NIPT筛查可以有效地减少侵入性产前诊断的人数,也降低了有创性产前诊断可能导致的不必要的胎儿丢失风险。但要明确的是,NIPT技术仍然是一项筛查检测,还需要对其检测的精准性进行大样本的临床验证,目前还不能完全取代胎儿样本CMA结果,不能作为终止妊娠的金标准[21]。本研究中未能对羊水穿刺结果确诊为致病性和可能致病性CNVs的所有胎儿进行父母CMA的验证,且对于新生儿结局的随访结果主要是电话沟通获得信息,缺少专业新生儿科医师的规范诊断,在后续的研究中需要注意改进。